استخدام عالية الدقة الأشعة تحت الحمراء الحراري (HRIT) لدراسة الجليد في النواة والجليد نشر في النباتات
Summary
Here we present a protocol that allows one to visualize sites of ice formation and avenues of ice propagation in plants utilizing high resolution infrared thermography (HRIT).
Abstract
Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events often have devastating effects on agricultural production and can also play an important role in shaping community structure in natural populations of plants, especially in alpine, sub-arctic, and arctic ecosystems. Therefore, a better understanding of the freezing process in plants can play an important role in the development of methods of frost protection and understanding mechanisms of freeze avoidance. Here, we describe a protocol to visualize the freezing process in plants using high-resolution infrared thermography (HRIT). The use of this technology allows one to determine the primary sites of ice formation in plants, how ice propagates, and the presence of ice barriers. Furthermore, it allows one to examine the role of extrinsic and intrinsic nucleators in determining the temperature at which plants freeze and evaluate the ability of various compounds to either affect the freezing process or increase freezing tolerance. The use of HRIT allows one to visualize the many adaptations that have evolved in plants, which directly or indirectly impact the freezing process and ultimately enables plants to survive frost events.
Introduction
يمكن أن انخفاض درجات الحرارة التي تحدث عند النباتات تنمو بنشاط أن تكون قاتلة، لا سيما إذا كان المصنع لديه القليل أو لا تسامح التجميد. مثل هذه الأحداث الصقيع غالبا ما يكون لها آثار مدمرة على الإنتاج الزراعي ويمكن أيضا أن تلعب دورا هاما في تشكيل بنية المجتمع في السكان الطبيعية من النباتات، وخاصة في جبال الألب، والنظم الإيكولوجية جنوب القطب الشمالي والقطب الشمالي 1-6. وكان حلقة من الصقيع الشديد الربيع تأثيرات كبيرة على إنتاج الفاكهة في الولايات المتحدة الأمريكية وأمريكا الجنوبية في السنوات الأخيرة 7-9 وتفاقمت الاصابة المبكرة الطقس الحار تليها انخفاض درجات الحرارة يعني أكثر نموذجية. الحث على الطقس الحار في وقت مبكر براعم لكسر، وتفعيل نمو البراعم الجديدة، الأوراق، والأزهار وكلها لها القليل جدا من دون الصقيع التسامح 1،3،10-12. تم الإبلاغ عن مثل هذه الأنماط المناخية المتقلبة لتكون انعكاسا مباشرا لتغير المناخ الجاري، ومن المتوقع أن يكون نمط الطقس مشترك لفوريسالمستقبل eeable 13. والجهود الرامية إلى توفير تقنيات إدارة اقتصادية وفعالة وصديقة للبيئة أو المواد الكيميائية الزراعية التي يمكن أن توفر زيادة التسامح الصقيع نجاح محدود لمجموعة من الأسباب ولكن هذا يمكن أن يعزى ذلك جزئيا إلى الطبيعة المعقدة لتجميد التسامح وتجميد آليات تجنب في النباتات. 14
وقد جرت العادة على تقسيم آليات التكيف المرتبطة بقاء الصقيع في النباتات إلى فئتين، تجميد التسامح وتجميد الإبطال. ويرتبط الفئة الأولى مع الآليات البيوكيميائية التي تنظمها مجموعة محددة من الجينات التي تسمح النباتات على تحمل الضغوط المرتبطة مع وجود وتأثير dehydrative من الجليد في أنسجته. في حين أن الفئة الأخيرة هي عادة، ولكن ليس وحدها، ويرتبط مع الجوانب الهيكلية للمحطة التي تحدد إذا، متى وأين أشكال الجليد في مصنع 14. على الرغم من انتشار تجنب تجميد بمثابة إعلانآلية aptive، وقد خصص القليل من الأبحاث في الآونة الأخيرة لفهم الآليات الكامنة وتنظيم تجنب التجميد. يشار إلى القارئ إلى مراجعة حديثة 15 لمزيد من التفاصيل حول هذا الموضوع.
في حين أن تشكيل الجليد في درجات الحرارة المنخفضة قد يبدو وكأنه عملية بسيطة، وتساهم العديد من العوامل في تحديد درجة الحرارة التي الجليد nucleates في أنسجة النبات وكيفية انتشاره داخل المصنع. يمكن المعلمات مثل وجود خارجي والجليد جوهري nucleators، غير المتجانسة مقابل الأحداث التنوي متجانسة، الحرارية التباطؤ (مضاد) البروتينات، فإن وجود من السكريات محددة وosmolytes الأخرى، ومجموعة من الجوانب الهيكلية من النبات جميع تلعب كبيرة دور في عملية التجميد في النباتات. بشكل جماعي، هذه المعايير تؤثر درجة الحرارة التي يتجمد النبات، حيث يبدأ الجليد وكيف أنها تنمو. ويمكن أن يؤثر أيضا على مورفولوجية بلورات الثلج الناتجة عن ذلك.وقد استخدمت أساليب مختلفة لدراسة عملية التجميد في النباتات تحت ظروف المختبر، بما في ذلك التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR) 16، والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) 17، البرد المجهر 18-19، ودرجات الحرارة المنخفضة المجهر الإلكتروني (LTSEM ) 20 تجميد النباتات الكاملة في إعدادات المختبرية والميدانية، ومع ذلك، فقد تم رصدها بشكل رئيسي مع المزدوجات الحرارية. ويستند استخدام المزدوجات الحرارية لدراسة تجميد على تحرير الحرارة (حرارة الانصهار) عندما يمر الماء مرحلة انتقالية من الحالة السائلة إلى الحالة الصلبة. ثم يتم تسجيل تجميد كحدث طارد للحرارة. 21-23 على الرغم من المزدوجات الحرارية هي طريقة نموذجية من خيار في دراسة التجمد في النباتات، واستخدامها لديها الكثير من القيود التي تحد من كمية المعلومات التي تم الحصول عليها خلال الحدث التجمد. على سبيل المثال، مع المزدوجات الحرارية فمن الصعب المستحيل تقريبا لتحديد أين يبدأ الجليد في النباتات، وكيف ينتشر،إذا كان ينتشر بمعدل حتى، وإذا بقيت بعض الأنسجة خالية من الجليد.
التقدم في عالية الدقة الحراري بالأشعة تحت الحمراء (HRIT) 24-27، ومع ذلك، فقد زادت بشكل كبير من القدرة على الحصول على المعلومات حول عملية التجميد في مصانع بأكملها، خصوصا عند استخدامها في وضع التصوير التفاضلية. 28-33 وفي هذا التقرير، ونحن وصف استخدام هذه التكنولوجيا لدراسة مختلف جوانب عملية التجميد ومختلف العوامل التي تؤثر فيها، ووفي ما الجليد درجة الحرارة يبدأ في النباتات. وسيعرض البروتوكول الذي سوف تثبت قدرة الجليد التنوي النشطة (INA) بكتيريا، الزائفة syringae (CIT-7) ليكون بمثابة nucleator خارجي الشروع في تجميد نبات عشبي في العالية ودرجات الحرارة تحت الصفر.
عالية الدقة تعمل بالأشعة تحت الحمراء
البروتوكول، والأمثلة الموثقة في هذا التقرير الاستفادة دقة عالية الأشعة تحت الحمراءالاشعاع الفيديو. والاشعاع (الشكل 1) لوازم مجموعة من الصور طيف الأشعة تحت الحمراء والمرئية والبيانات درجة الحرارة. الاستجابة الطيفية للكاميرا هي في حدود 7،5 حتي 13،5 ميكرون، ويوفر 640 × 480 بكسل. صور الطيف المرئية التي تم إنشاؤها بواسطة كاميرا يمكن أن تنصهر مع IR-الصور في الوقت الحقيقي، مما يسهل تفسير المعقدة والصور الحرارية في مدمجة. وهناك مجموعة من العدسات للكاميرا يمكن أن تستخدم لجعل عن قرب والملاحظات المجهرية. ويمكن استخدام الكاميرا في وضع قائمة بذاتها، أو ربطه والتي تسيطر عليها مع جهاز كمبيوتر محمول باستخدام برنامج propietary. يمكن استخدام البرنامج للحصول على مجموعة متنوعة من البيانات الحرارية جزءا لا يتجزأ من أشرطة الفيديو المسجلة. من المهم أن نلاحظ أن مجموعة واسعة من الإشعاع الأشعة تحت الحمراء متوفرة تجاريا. وبالتالي، فمن الضروري أن الباحث مناقشة تطبيقها المقصود مع مهندس المنتج على دراية وأن الباحث اختبار قدرة أي specifiج الاشعاع لتوفير المعلومات اللازمة. يتم وضع الاشعاع التصوير المستخدمة في بروتوكول صفها في مربع الاكريليك (الشكل 2) معزول مع الستايروفوم ط ن أجل ردع التعرض لتكاثف خلال بروتوكولات التدفئة والتبريد. ليست هناك حاجة هذه الحماية لجميع الكاميرات أو التطبيقات.
Protocol
Representative Results
Discussion
الماء لديه القدرة على التبريد الفائق لدرجات حرارة أقل بكثير من 0 درجة مئوية ودرجة حرارة المياه التي ستجمد يمكن أن تكون متغيرة تماما. 36 الحد الأقصى لدرجات الحرارة والبرودة الفائقة من الماء النقي حوالي -40 ° C ويتم تعريف كنقطة التنوي متجانسة. عندما يتجمد الماء عند د…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا البحث من قبل صندوق العلوم النمساوية (FWF): P23681-B16.
Materials
| Infrared Camera | FLIR | SC-660 | Many models available depending on application |
| Infrared Analytical Software | FLIR | ResearchIR 4.10.2.5 | $3,500 |
| Pseudomonas syringae (strain Cit-7) | Kindly provided by Dr. Steven Lindow, University of California Berkeley icelab@berkeley.edu | ||
| Pseudomonas Agar F | Fisher Scientific | DF0448-17-1 |
References
- Taschler, D., Beikircher, B., Neuner, G. Frost resistance and ice nucleation in leaves of five woody timberline species measured in situ during shoot expansion. Tree Physiol. 24, 331-337 (2004).
- Neuner, G., Hacker, J., Lütz, C. Ice formation and propagation in alpine plants. Plants in alpine regions: Cell Physiology of adaptation and survival strategies. , 163-174 (2012).
- Ladinig, U., Hacker, J., Neuner, G., Wagner, J. How endangered is sexual reproduction of high-mountain plants by summer frosts? – Frost resistance, frequency of frost events and risk assessment. Oecologia. 171, 743-760 (2013).
- Wisniewski, M. E., Gusta, L. V., Fuller, M. P., Karlson, D., Gusta, L. V., Wisniewski, M. E., Tanino, K. K. Ice nucleation, propagation and deep supercooling: the lost tribes of freezing studies. Plant Cold Hardiness: from the laboratory to the field. , 1-11 (2009).
- Bokhurst, S., Bjerke, J. W., Davey, M. P., Taulavuori, K., Taulavuori, E., Laine, K., Callaghan, T. V., Phoenix, G. K. Impacts of extreme winter warming events on plant physiology in a sub-Arctic heath community. Physiol. Plant. 140, 128-140 (2010).
- Taulavuori, K., Laine, K., Taulavuori, E. Experimental studies on Vaccinium myrtillus.and Vaccinium vits-idea.in relation to air pollution and global change at northern high latitudes: A review. Env. Exp. Bot. 87, 191-196 (2013).
- Wisniewski, M., Glenn, D. M., Gusta, L., Fuller, M. Using infrared thermography to study freezing in plants. HortScience. 43, 1648-1651 (2008).
- Gu, L., et al. The 2007 eastern US spring freeze: increased cold damage in a warming world. BioScience. 58, 253-262 (2008).
- Augspurger, C. K. Spring warmth and frost: phenology, damage, and refoliation in a temperate deciduous forest. Func. Ecol. 23, 1031-1039 (2007).
- Neuner, G., Erler, A., Hacker, J., Ladinig, U., Wagner, J. Frost resistance of reproductive tissues in various reproductive stages of high alpine plant species. Physiol. Plant. 147, 88-100 (2013).
- Skre, O., Taulavuori, K., Taulavuori, E., Nilsne, J., Igeland, B., Laine, K. The importance of hardening and winter temperature for growth in mountain birch populations. Env. Exp. Bot. 62, 254-266 (2008).
- Hänninen, H., Tanino, K. Tree seasonality in a warming climate. Trends in Plant Science. 16, 412-416 (2011).
- Katz, R. W., Brown, B. G. Extreme events in a changing climate: variability is more important than averages. Climate Change. 21, 289-302 (1992).
- Wisniewski, M., Gusta, L. Understanding plant cold hardiness: an opinion. Physiol. Plant. 147, 4-14 (2013).
- Wisniewski, M., Gusta, L., Neuner, G. Adaptive mechanisms of freeze avoidance in plants. A brief update. Env. Exp. Bot. 99, 133-140 (2014).
- Burke, M. J., Gusta, L. V., Quamme, H. A., Weiser, C. J., Li, P. H. Freezing and injury in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. 27, 507-528 (1976).
- Ishikawa, M., Price, W. S., Ide, H., Arata, Y. Visualization of freezing behaviors in leaf and flower buds of full-moon maple by nuclear magnetic resonance microscopy. Plant Physiol. 115 (4), 1515-1524 (1997).
- Ishikawa, M., Sakai, A., Li, P. H., Sakai, A. Characteristics of freezing avoidance in comparison with freezing tolerance: a demonstration of extra-organ freezing. Plant cold hardiness and freezing stress. , 325-340 (1982).
- Buchner, O., Neuner, G. Freezing cytorrhysis and critical temperature thresholds for photosystem II in the peat moss Sphagnum capillifolium. Protoplasma. 243 (1), 63-71 (2010).
- Pearce, R. S. Extracellular ice and cell shape in frost-stressed cereal leaves: A low temperature scanning electron microscopy study. Planta. 175, 313-324 (1988).
- Ashworth, E. N., Anderson, J. A., Davis, G. A., Lightner, G. W. Ice formation in Prunus persica. under field conditions. J. Am. Soc. Hort. Sci. 110 (3), 322-324 (1985).
- Ashworth, E. N., Davis, G. A. Ice formation in woody plants under field conditions. HortSci. 21, 1233-1234 (1986).
- Pramsohler, M., Hacker, J., Neuner, G. Freezing pattern and frost killing temperature of apple (Malus domestica.) wood under controlled conditions and in nature. Tree Physiol. 32 (7), 819-828 (2012).
- Wisniewski, M., Lindow, S. E., Ashworth, E. N. Observations of ice nucleation and propagation in plants using infrared video thermography. Plant Physiol. 113 (2), 327-334 (1997).
- Lutze, J. L., et al. Elevated atmospheric [CO2] promotes frost damage in evergreen tree seedlings. Plant Cell Environ. (6), 631-635 (1998).
- Ball, M. C., et al. Space and time dependence of temperature and freezing in evergreen leaves). Func. Plant Biol. 29 (11), 1259-1272 (2002).
- Sekozawa, Y., Sugaya, S., Gemma, H. Observations of ice nucleation and propagation in flowers of Japanese Pear (Pyrus Pyrifolia). Nakai) using infrared video. 73 (1), 1-6 (2004).
- Hacker, J., Neuner, G. Ice propagation in plants visualized at the tissue level by IDTA (infrared differential thermal analysis). Tree Physiol. 27, 1661-1670 (2007).
- Hacker, J., Neuner, G. Ice propagation in dehardened alpine plant species studied by infrared differential thermal analysis (IDTA). Arc. Antarc. Alp. Res. 40 (4), 660-670 (2008).
- Hacker, J., Spindelböck, J., Neuner, G. Mesophyll freezing and effects of freeze dehydration visualized by simultaneous measurement of IDTA and differential imaging chlorophyll fluorescence. Plant Cell Environ. 31, 1725-1733 (2008).
- Neuner, G., XU, B., Hacker, J. Velocity and pattern of ice propagation and deep supercooling in woody stems of Castanea sativa., Morus nigra. and Quercus robur. measured by IDTA. Tree Physiol. 30, 1037-1045 (2010).
- Hacker, J., Ladinig, U., Wagner, J., Neuner, G. Inflorescences of alpine cushion plants freeze autonomously and may survive subzero temperatures by supercooling. Plant Sci. 180, 149-156 (2011).
- Kuprian, E., Briceno, V., Wagner, J., Neuner, G. Ice barriers promote supercooling and prevent frost injury in reproductive buds, flowers and fruits of alpine dwarf shrubs throughout the summer. Env. Exp. Bot. 106, 4-12 (2014).
- Wisniewski, M., Glenn, D. M., Fuller, M. Use of a hydrophobic particle film as a barrier to extrinsic ice nucleation in tomato plants. HortScience. 127, 358-364 (2002).
- Aryal, B., &Neuner, G. Leaf wettability decreases along an extreme altitudinal gradient. Oecologia. 162, 1-9 (2010).
- Wisniewski, M., Fuller, M. P., Margesin, R., Schinner, F. . Ice nucleation and deep supercooling in plants: new insights using infrared thermography. In: Cold adapted organisms. Ecology, physiology, enzymologyandmolecularbiology. , 105-118 (1999).
- Franks, F. . Biophysics and biochemistry at low temperatures. , (1985).
- Neuner, G., Kuprian, E., Hincha, D., Zuther, E. Infrared thermal analysis of plant freezing processes. Methods in Molecular Biology: Plant Cold Acclimation. , 91-98 (2014).
