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Bioengineering

Medição do isométrica máxima força gerada pelo permeabilizadas fibras musculares esqueléticas

Published: June 16, 2015
doi:
10.3791/52695
, , , ,
1Department of Orthopaedic Surgery,University of Michigan Medical School, 2Department of Molecular & Integrative Physiology,University of Michigan Medical School, 3Department of Biomedical Engineering,University of Michigan Medical School, 4Department of Surgery, Section of Plastic Surgery,University of Michigan Medical School

Summary

Análise das propriedades contráteis das fibras musculares esqueléticas, pele quimicamente, ou permeabilizadas oferece um poderoso meio para avaliar a função muscular ao nível da célula muscular único. Neste artigo vamos descrever uma técnica válida e confiável para preparar e testar permeabilizadas fibras musculares esqueléticas in vitro.

Abstract

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

Introduction

A função primária do músculo esquelético é de gerar força. Força muscular é provocada in vivo através de uma complexa seqüência de eventos que inclui os potenciais de ação dos nervos motores, a transmissão neuromuscular, potenciais de ação das fibras musculares, liberação de cálcio intracelular e ativação do sistema de proteínas reguladoras e contráteis. Porque a geração de força é o resultado final desta sequência, um défice em vigor pode ser causado por uma falha de um ou mais dos passos individuais. Um atributo chave de preparação de fibras permeabilizadas é que elimina a maior parte das etapas necessárias para a geração de força in vivo, com apenas as funções de regulação e contrácteis associados com o aparelho restante miofibrilar. O investigador assume o controlo sobre a entrega de cálcio e ativação de energia (ATP), e é recompensado com um sistema simplificado que permite a avaliação das estruturas reguladoras e contráteis isolado em sua co nativanfiguration. Medidas de força, utilizando fibras musculares esqueléticas permeabilizadas são, portanto, valioso ao avaliar alterações na função muscular observadas in vivo. Por exemplo, temos utilizado essa técnica para caracterizar a capacidade de geração de força de fibras de miostatina camundongos deficientes 1 e para avaliar a causa da fraqueza muscular persistente exibiu seguinte crônica do manguito rotador lágrimas 2,3.

Metodologia de fibras permeabilizadas moderna pode ser atribuída ao início dos estudos influentes 4,5 e está atualmente em uso por um número de grupos de pesquisa. Embora as técnicas têm sido descritas na literatura, eles ainda não foram apresentadas em formato de vídeo. O objetivo deste artigo é ilustrar, uma técnica válida e confiável atualizada para medir a capacidade máxima de geração de força de fibras individuais a partir de amostras de músculo esquelético quimicamente permeabilizadas. Para conseguir isso, um segmento individual de fibra (aqui referido como um ̶0; fibra ") é extraído a partir de um pacote pré-permeabilizadas de fibras e colocado numa câmara experimental contendo uma solução de repouso, a característica definidora de que é uma concentração de cálcio que é <10 nM. A fibra é então ligado numa extremidade a um transdutor de força-e na outra extremidade a um comprimento-controlador. Com a fibra mantida a um comprimento sarcómero óptima, a mesma é transferida para uma solução de activação que tem uma concentração de cálcio suficiente para induzir a activação máxima e assim a máxima força de contracção isométrica. Força dados são adquiridos, armazenados e analisados ​​utilizando um computador pessoal.

Protocol

Todos os procedimentos que envolvem seres humanos ou animais deve ser realizado em conformidade com as orientações relevantes, regulamentações e agências reguladoras. A Universidade de Michigan Comitê sobre o Uso e tratamento dos animais (UCUCA) e da Universidade de Michigan Medical Center Institutional Review Board aprovou todos os animais e os procedimentos humanos descritas neste artigo. 1. Verifique que disseca e armazenamento Stock Solution Nota: Os volumes finais especificados nas instruções a seguir pode ser escalado para cima ou para baixo se o desejar. Para um copo de 1000 ml adicionar 800 ml de água desionizada (ASTM Tipo 1). A manutenção de uma agitação suave, adicionar todos os compostos listados na Tabela 1 com a água desionizada e permitir que eles se dissolvem. Composto Desejado Conc. (H) Fórmula Peso (g / mol) Adicionar a 1 L (g) </ Tr> K-propionato 0,250 112,17 28,040 Imidazol 0,040 68,08 2.720 EGTA 0,010 380,40 3.800 MgCl2 • 6H 2 O 0,004 203,31 0,813 Tabela 1: Dissecando e solução estoque de armazenamento componentes. Levar o volume final de 1.000 ml com água desionizada. Note-se que não é necessário o pH da solução no momento. Guardar a solução estoque a 4 ° C. 2. Faça Solução de Armazenamento Para fazer 200 ml de solução de armazenamento, começar com 100 ml de solução de estoque de dissecação e armazenamento num copo de 250 ml. Adicionar suficiente de Na 2 H 2 ATP para trazer adenosina definitivatrifosfato (ATP), a concentração de 2 mM. Levar o volume final de 200 ml com glicerol. Ajustar a pH 7,00 com hidróxido de potássio (KOH). Guardar a solução de armazenamento a -20 ° C. Nota: devido à natureza viscosa do glicerol que pode ser difícil para dispensar com precisão em volume. Devido a isso, que tipicamente adicionar o glicerol, em peso (100 ml de glicerol pesa cerca de 126 g). 3. Faça Solution disseca Para fazer 200 ml de solução de dissecação, começar com 100 ml de solução de estoque de dissecação e armazenamento num copo de 250 ml. Adicionar suficiente de Na 2 H 2 ATP para trazer a concentração final para ATP 2 mM. Ajustar o pH a 7,00 com KOH. Levar o volume final para 200 ml com água desionizada. Da alíquota em volumes de 2,5 ml e armazenar a -80 ° C. 4. Faça Dissecando Solution com Brij 58 Nota: Brij 58 é um detergente não iónico que interrompe (permeabiliza) bicamadas lipídicas. <ol> Para fazer 200 ml de solução com Brij 58 dissecando, começar com 200 ml da solução de dissecação num copo de 250 ml. A manutenção de uma agitação suave, adicionar 1 g de Brij 58 (0,5% w / v) à solução de dissecação e deixar dissolver. Da alíquota em volumes de 2,5 ml e armazenar a -80 ° C. 5. Certifique-Testing Solutions Nota: O seguinte é adaptado de Moisescu Thieleczek e 1978 (6). Veja a discussão para comentários adicionais sobre a preparação de soluções de testes. Prepare três separados 1.000 ml provetas rotulados como "relaxante", "Pré-activação" e "Activar". Adicionar 400 ml de água desionizada a cada copo. Adicionar os compostos indicados na Tabela 2 para o copo apropriado e, em seguida, aquecer as soluções para entre 70 ° C e 80 ° C. Manter uma temperatura de solução de 70-80 ° C durante 30 min enquanto se agitava continuamente. Nota: A temperatura de 70-80 ° C auxilia na eliminação de ácido carbónico formado pela reacção do carbonato de cálcio com EGTA na solução de activação. As soluções de solução e pré-activação relaxantes são tratados da mesma forma que a solução de activação para manter a consistência. SOLUÇÃO relaxante PRÉ-ATIVAÇÃO SOLUÇÃO ATIVAÇÃO DE SOLUÇÃO Composto Fórmula Peso (g / mol) Concentração desejada (mM) Obrigatório Massa (g) Concentração desejada (mM) Obrigatório Massa (g) Concentração desejada (mM) Obrigatório Massa (g) HEPES (ácido) 238,30 90,0 10,724 90,0 10,724 90.00 10,724 MgO 40,31 10.3 0,208 8.5 0,171 8.12 0,164 EGTA (ácido) 380,40 52,0 9,890 52.00 9,890 HDTA (ácido) 348,36 50,0 8,709 CaCO3 100,10 50,00 2,503 Tabela 2: Relaxing, pré-activação de activação e os componentes da solução. Arrefece-se a solução até à temperatura ambiente e adiciona-se suficiente NaN3 / KOH para trazer a concentração final de NaN 3 a 1 ​​mM. CUIDADO: NaN3 (azida de sódio) é venenoso. Consulte as MSDS químicos antes da manipulação do produto químico. Para perfazer 100 ml de solução de azida de sódio 100 mM, adicionar 0,65 g de NaN 3 a 10 ml de 1 N KOH. Ajustar para um volume final de 100 ml com água desionizada. Ajustar o pH para cerca de 7,10 utilizando KOH. A seguir ao passo de 5,4 adiciona-se suficiente de Na 2 H 2 ATP para levar a concentração final de ATP de 8 mM e Na 2 CRP suficiente para trazer a phosophate creatina final (PCR) para a concentração de 10 mM. Traga cada solução para o volume final de 500 ml, utilizando água desionizada. Frio ou aquecer as soluções para a temperatura à qual será realizado experiências, em seguida, usar KOH para trazero pH para 7,10, mantendo essa temperatura. Adicionar solução para a proveta contendo a solução de pré-activação que relaxa de modo a que a solução final de pré-activação é de 1 parte de solução em 500 solução de pré-activação relaxante. Da alíquota em volumes de 2,5 ml e armazenar a -80 ° C. 6. Faça sutura Loops Comece com um fio de não-estéril USP 10-0 monofilamento de nylon de sutura. Use a pinça para criar um laço com a cadeia utilizando a técnica nó overhand dupla. Reduzir o nó em tamanho a cerca de 750 um de diâmetro. Diâmetro de loop pode ser avaliada sob o microscópio usando marcações retícula ocular. Use microdissecting tesoura para remover o excesso de sutura deixando apenas o loop e pequenas (500 um) caudas em ambos os lados. Um exemplo de um ciclo final é mostrado na Figura 1. Repita os passos de 6,2-6,3 até 4 loops utilizáveis ​​foram feitas. Loja laços em um banhado a elastômero de silicone petri prato para uso futuro. Nota: Quatro ciclos de sutura são necessários para todas as fibras testadas. 7. Bundle Amostra Nota: Os passos seguintes descrevem o procedimento para dissecar a amostra original em 'pacotes' experimentais menores do que as fibras individuais acabará por ser extraídas e testadas. Em todos os momentos, a amostra deve ser tratado com cuidado. Para a finalidade desta descrição, serão dadas instruções quanto o investigador se é destro. Obter a amostra de interesse e transferi-lo para a instalação onde dissecção terá lugar. Nota: Métodos de biópsia do tecido irá variar dependendo do modelo experimental e desenho do estudo. Sempre que possível, a perfusão muscular deve ser mantido até o momento da biópsia. Se a amostra está a ser transferida entre o local de colheita e o local de dissecação, transportá-lo em um frasco contendo uma solução de dissecação gelada enquanto mantido em gelo. Prepara-se uma placa de Petri de silicone 5 centímetros elastómero-revestida com solução de dissecação e refrigeradas 2-3 pinos de montagem de insectos (100 um de diâmetro, de aço inoxidável). Transferir a amostra para o prato. Certifique-se de que a amostra permanece submersa pela adição de mais solução de dissecação, se necessário. Inspeccionar a amostra ao microscópio e manipulá-lo para alinhar os eixos longitudinais das fibras para o ombro direito do investigador (Figura 2). Em seguida, a amostra para ancorar o prato de fixação nos cantos. Nota: Fazer uso de qualquer tecido conjuntivo permanecendo como pontos de ancoragem neste momento uma vez que este irá maximizar o uso da amostra e conservar a integridade da fibra. O pacote pode ser fixado em ligeira tensão para ajudar a definir as margens de inter-fibras. Com a pinça na mão esquerda e as tesouras microdissecting na direita, começar dissecando cuidadosamente um pacote ao longo das margens longitudinais entre as fibras Nota: Dependendo do seucomprimento total, dissecar ainda mais o pacote em vários pacotes menores. Certifique-se de que as dimensões do pacote medem cerca de 0,5-1 mm de largura e ≥3 mm de comprimento. Avaliar as dimensões usando um microscópio com marcações retícula na ocular, ou colocando uma régua sob o prato. Remover e eliminar qualquer tecido que está danificado pelos fórceps ou pinos como um resultado do processo de dissecação. Repita o processo até que um número suficiente de pacotes foram dissecados ou até que a amostra tenha sido esgotada. Nota: O número de pacotes que podem ser obtidos dependerá de numerosos factores, incluindo o tamanho e condição da amostra inicial, a morfologia do músculo, e a habilidade do investigador. 8. Fibras permeabilizar Transferir os feixes de a solução de dissecção para um frasco contendo 2,5 ml de frescos, refrigerados, dissecando solução com o detergente não-iónico 'Brij 58' adicionou(0,5%, w / v). Incubar em gelo durante 30 min com ocasional, agitação suave. Certifique-se de que os pacotes permanecem submersas durante todo incubação. No final da incubação de 30 minutos, transferir os pacotes para um frasco contendo uma solução de dissecação fresco (sem Brij 58) e agitar suavemente e rapidamente para remover qualquer detergente restante. 9. Prepare Bundles para Armazenamento Transferir os feixes a um frasco contendo uma solução de armazenamento refrigeradas e incubar durante a noite a 4 ° C. 10. Loja Bundles No dia seguinte, preparar uma caixa de armazenamento, capaz de suportar -80 ° C, com 0,5 ml suficientes individuais tampa de rosca tubos cônicos para acomodar todos os pacotes obtidos durante o processo de dissecação (um pacote por tubo). Cada tubo cónico deve ser enchido com 200-400 ul de solução de armazenamento de fresco. Transferir os pacotes para os tubos cônicos marcados individualmente. Certifique-se de que o pacote não está preso ao lado do tubo cónico ou flutuando na superfície da solução. Tapar os tubos cónicos e armazenar as amostras à temperatura de -80 ° C até ao dia do ensaio. 11. Prepare aparato experimental Nota: O aparelho de costume é composto de uma fase que abriga um transdutor de força e controlador de comprimento, um sistema de câmara e movendo-se um microscópio de dissecção 10X. Instalações de accionamento micrómetro permitir a manipulação de precisão de superfícies de ligação de fibra. Padrões de difração a laser são usadas para estimar o comprimento do sarcômero. Os dados gerados no decurso da experimentação é registada num computador pessoal. Consulte a Figura 3 para imagens anotados do experimental set-up. Descongelar um frasco cada um dos relaxante, pré-activação e soluções ativadoras e manter em gelo. Note-se que o ATP e PCR são compostos lábeis que devem ser mantidos a baixas temperaturas. Prepara-se o microscópio, a aparelhagem de ensaio e computador associado para uso. </li> Encha a primeira câmara experimental com solução relaxante. No nosso dispositivo, a primeira câmara contém prismas que permitem que o investigador para fotografar a fibra a partir do lado. Encha a segunda câmara experimental com solução de pré-activação eo terceiro com uma solução de ativação. Ajustar a temperatura de modo a que o visor termómetro na câmara lê-15 ° C. Linha dois loops de sutura preparados sobre as superfícies de fixação de aço inoxidável estendendo-se a partir de ambos o transdutor força-comprimento e-controlador (Figura 5A). 12. Extrato permeabilizadas única fibra Descongelar um feixe de fibras de interesse, e transferir para uma placa de Petri de silicone elastômero banhado com frescos, solução relaxante refrigerados. Prenda o pacote com pinos em cada extremidade e garantir que ele está submerso. Usando fórceps, agarrar uma fibra em uma extremidade e começar a extrair suavemente ao longo do seu eixo longitudinal. Nota: O dano à compressão para oextremidade da fibra causada pelos fórceps não é uma preocupação uma vez que neste momento as propriedades contrácteis nesta área não vai ser testado. Cuidados devem, no entanto, ser feita a partir de fibras ao extrair o feixe desde aderências entre as fibras e a matriz extracelular pode resultar em tensão excessiva, conduzindo finalmente induzida por danos ao esticar. Note-se que existe uma considerável variabilidade entre os músculos do grau em que as fibras aderem à matriz extracelular circundante. Fibras que são suspeitas de terem sido danificadas por esse trecho deve ser descartada. Utilize uma lâmina de bisturi ou para modificar a ponta da pipeta, como mostrado na (Figura 4). Introduzir a fibra para a ponta, juntamente com uma pequena quantidade de solução de relaxamento. Transferir a única fibra a partir da placa de petri de silicone de elastómero-plaqueadas para a câmara experimental que contém a solução relaxante. 13. Monte única fibra Nota: Uma depicti passo-a-passono pode ser visto na Figura 5. Orientando suavemente com a pinça, remover a fibra a partir da ponta de pipeta e inseri-la ao controlador comprimento (esquerda), utilizando o primeiro laço de sutura. Use um único movimento, suave ao apertar o laço com a pinça. Assegure-se que uma tensão igual e oposta é aplicada a cada extremidade da sutura. O primeiro circuito deve ser amarrada a cerca de 1 mm a 2 mm a partir da extremidade da superfície de fixação do comprimento-controlador. Manipular a outra extremidade da fibra para o transdutor de força (à direita) e fixar a fibra usando o mesmo procedimento. Remover o excesso de sutura usando a tesoura microdissecting (Figura 5C). Colocar a fibra sob uma pequena quantidade de tensão por aumento da distância entre o comprimento-controlador e força-o usando transdutores braços (Figura 3A) coordenada x unidade micrométrica. Passe o segundo laço sobre o primeiro e ancorar a fibraem um ponto dentro de 0,2 milímetros da ponta da superfície de fixação do transdutor de força-(Figura 5D). Remover o excesso de sutura usando a tesoura microdissecting. O processo de ligação de fibra pode resultar numa perda da solução a partir da câmara. Se necessário, adicionar solução mais relaxante para assegurar que a superfície da solução é plana (nem côncavo nem convexo). A superfície plana é importante quando se avalia comprimento do sarcômero usando difração de raios laser. Alinhar a fibra paralela às paredes laterais da câmara experimental, ajustando a posição do controlador comprimento na direcção do eixo y. Levantamento da fibra usando a vista lateral do prisma e ajustar a posição do controlador comprimento na direcção do eixo z, até a fibra é paralelo ao chão da câmara. Nota: Posicionamento da fibra paralela ao chão da câmara pode ser realizado sem prismas câmara, concentrando-se em primeiro lugar numa extremidade da fibra e tgalinha, sem ajustar a focagem do microscópio, trazendo a outra extremidade da fibra em foco utilizando a sua unidade micrométrica eixo z. Se a fibra é de qualquer maneira retorcido, torcido ou danificada como um resultado do processo de montagem, a fibra deve ser descartada e uma nova fibra em anexo. 14. Set Optimal comprimento de sarcômeros Quando a fibra tenha sido correctamente alinhados no interior da câmara, inserção da tela alvo calibrado para a face anterior do microscópio e alinhá-lo através da primeira câmara experimental. Nota: A tela de destino é calibrado usando a equação da rede padrão, λ = sinθ SL, em que SL é comprimento sarcómero, θ é o ângulo de difracção entre os 0 ° C e 1 ° feixes difractados e λ é o comprimento de onda do laser. Ligue o laser e ajustar a posição da fase de modo a que o laser passa através do centro da fibra. CUIDADO: concentrado de luz laser pode ser prejudicial to visão. Nunca tente visualizar a fibra através do microscópio quando o laser está ligado. Posicionar a fibra em relação ao feixe de laser para difractar a luz do laser e observar um alinhador interferência na tela alvo calibrado (Figura 6). Desligue as luzes para visualizar mais claramente este padrão. Nota: Se, com o posicionamento correcto do feixe de laser, nenhum padrão de interferência é visto, isto sugere que os componentes miofibrilares da fibra são anormais / danificados e que a fibra deve ser substituída por uma nova. Para definir o comprimento do sarcómero, aumentar ou diminuir a tensão na fibra usando o micrómetro unidade eixo-x comprimento-controlador até que o espaçamento desejado da luz difractada é observado no ecrã do alvo. Nota: O comprimento do sarcómero óptima da fibra vai depender da espécie do animal a partir do qual se obteve a amostra. Um comprimento do sarcômero de 2,7 mm é comumente assumido como sendo ideal quando jumentoscante fibras de 7,8 tecido humano. Depois de comprimento do sarcômero óptima foi definida, medir a distância entre as duas suturas mais íntimos. Isto é mais facilmente conseguido usando o visor digital, na unidade de micrómetro que controla o movimento do eixo x da câmara. Posicionar a câmara de tal modo que o cabelo transversal vertical da ocular está alinhada na fronteira mais interior do fio de sutura mais interna e zero a leitura digital na unidade micrométrica. Traduzir a fase ao longo do eixo X em relação ao microscópio até chegar ao outro sutura mais interna. O vídeo digital vai indicar o comprimento da fibra. Este valor deve ser registado como o comprimento das fibras, L f. Nota: Deve entender-se que a distância entre as duas suturas mais interiores vai determinar a duração funcional do tecido contráctil a ser avaliado. O investigador deve se esforçar para manter a consistência nesta dimensão (ou seja, L f) dentro de umsérie de experiências. 15. Estimativa Transversal Área (CSA) Manter as fibras em L F e utilizar a câmara montada no microscópio para capturar uma imagem de alta ampliação da porção central da fibra, tanto do topo e vistas laterais. Vista Lateral imagens podem ser capturadas utilizando o prisma incorporado no lado da câmara. Nota: Quando mudar entre superior e vistas laterais é importante para mover o microscópio apenas na direção y para garantir que as duas imagens são "no registo" e, portanto, mostram duas visões diferentes da mesma secção da fibra. Obter medições neste momento para normalizar força absoluta mais tarde no estudo. As técnicas para obtenção destas medições são descritas mais adiante e ilustrado nas Figuras 7A e 7B. 16. Extrair contração isométrica Nota: Enquanto os dados gerados durante estes experimentos podem ser recolhidos e interpretados sem a utilização de um computador, o software que permite a aquisição, exposição, armazenamento e análise das respostas de força é vantajosa. O software LabVIEW personalizado criado por nosso laboratório permite que essas funções, bem como a capacidade de projetar 'trens movimento "que governam a ação do controlador comprimento durante um experimento. Confirmar que a temperatura do repouso, pré-activação e soluções de activação são estáveis ​​a 15 ° C. Usar o software de controlo da câmara para mover a fibra para a câmara que contém a solução de pré-activação e incubar durante 3 min lá. Nota: A solução de pré-activação é fracamente tamponada para Ca2 +, o que resulta numa força de activação e desenvolvimento muito rápido após a introdução da fibra para a solução de activação. Com 10 seg restante na solução de pré-activação e o comprimento de fibra mantida a L f, estabelecer um zero fonível rce no registro experimental. Nota: o movimento do controlador comprimento A 'O Força Zero "revela o nível de força-transdutor que corresponde à força zero (isto é, a fibra torna-se brevemente folga, como resultado do movimento). A força passiva é a diferença entre zero e que o nível de força um pouco antes do movimento da truncatura transdutor. No final dos 3 minutos, mover-se a fibra para a câmara que contém a solução de activação e permitir que a força máxima isométrica de desenvolver tal como evidenciado por um patamar na força que é precedida por um aumento rápido. Depois de atingir a força máxima isométrica, usar o controlador para identificar o comprimento de saída do transdutor de força que corresponde à força zero na câmara que contém a solução de activação. Nota: Isto é necessário porque a saída do transdutor de força-que corresponde à força zero é, em geral, diferente para cada câmara cheia de solução. Após a realização de uma segunda força plateau, voltar a fibra para a câmara que contém a solução relaxante. Teste agora está completa. Para testar múltiplas fibras durante qualquer aspirado de uma sessão de todas as soluções e adicionar novas soluções refrigeradas. Nota: Os protocolos de ciclismo de Brenner deve ser considerado quando provocando contracções máximas ao longo de um período de tempo prolongado. Este protocolo foi mostrado para conservar as propriedades estruturais e mecânicas da fibra maximamente 9 activado.

Representative Results

Saudáveis, fibras quimicamente permeabilizadas individuais devem aparecer uniforme em forma e ter um intervalo entre estrias consistente quando visto sob alta ampliação. As fibras que são inflexíveis quando manipulado com a pinça ou com danos estruturais óbvios deve ser descartado. Imagens digitais de alta ampliação tomadas durante a etapa 15 são analisadas por 5 medições de diâmetro emparelhados ao longo da barriga da fibra. Fibra CSA é estimada assumindo uma secção transversal elíptica e uma média de 5 medições CSA individuais conforme mostrado na Figura 7A. Figura 7B também serve para ilustrar a forma como as dimensões da fibra em uma vista pode ser significativamente diferente, em comparação com as dimensões emparelhados na outra vista (isto é, transversal seções não são, em geral, e volta). Vestígios força representativos de fibras lenta e rápida humanas são mostrados nas Figuras 8A e 8B, respectivamente. Voltage de saída do transdutor de força-é adquirida durante o teste e convertido para forçar (MN) utilizando o software de aquisição de dados e análise (LabVIEW). A Figura 9 ilustra o método utilizado para avaliar a força activa máxima (Fo), que é calculado subtraindo a força necessária para manter a fibra com comprimento de sarcômero ideal, enquanto em um estado relaxado (força passiva, F P), a partir da maior força isométrica desenvolvida durante a ativação de fibra máxima (força total F T). Uma vez que a saída do transdutor de força-que corresponde à força zero é, em geral, diferente para cada uma das diferentes câmaras de banho, fazemos uma breve distender a fibra em ambos os pré-activação e activação soluções para capturar o nível da força de zero no registro experimental. A normalização da força máxima ativa por fibra CSA é usado para gerar o valor mais informativo de força específica (SF o). Porque leva em consideração o CSA da fibra, o sF </sub> fornece uma medida da capacidade de geração de força intrínseca do aparelho contráctil da fibra, permitindo assim comparações funcionais entre fibras de diferentes tamanhos. Deve, contudo, notar-se que as medições de CSA não é capaz de distinguir a proporção da fibra ocupada por filamentos contrácteis contra a proporção ocupada por outras estruturas subcelulares. As características típicas de adultos saudáveis, fibras de 2,011 Claflin et al. 10 de humano, Mendias et al., 2011 1 de rato e Gumucio et al., 2012 2 para o rato são detalhadas na Tabela 3. Todos os dados apresentados na Tabela 3 foram gerados utilizando o técnicas descritas neste artigo. Humano (Vasto lateral) </strong> Rato (EDL) Rato (Infra) Masculino Feminino Masculino Masculino Tipo 1 Tipo 2a Tipo 1 Tipo 2a (Não identificado) (Não identificado) CSA (2 uM) 4880 – 6900 5270 – 8380 3870 – 5470 4010 – 5610 1850 – 3080 5290 – 8010 F O (mn) 0,79-1,17 1,02-1,54 0,64-0,97 0,71-1,07 0,14-0,25 0,55-0,97 sF o (kPa) 142-182 165-210 156-193 172-214 67-94 102-131 n 129 160 149 207 37 94 Tabela 3. As características típicas de adultos saudáveis, fibras de músculo vasto lateral humano 10, rato extensor longo dos dedos 1 e 2 infra rato músculos. Comprimentos de sarcômero Optimal foram fixados em 2,7 mm para fibras humanos 7,8 e 2,5 mm tanto para rato (36, 37) e fibras de rato (38). Gamas Experimental L F (25 º e 75 º quartis) foram 1,39-1,73 mm, 1,17-1,53 mm e 1,32-1,59 mm para humanos, ratos e ratinhos, respectivamente. Intervalos mostrados indicam os dias 25 e 75 th quartis e n ​​é o número de fibras testadas. Os problemas mais comuns experimentados durante os testes incluem um deslizamento laço de sutura, o que resulta em uma força response com um "captura", tal como o ilustrado na Figura 10A, e um rasgo de espessura parcial ou total da fibra, o que resulta em uma resposta força que retorna bruscamente na direcção de ou para (pausa) zero, enquanto a fibra ainda está imerso na solução de activação (Figura 10B). Se um deslize, lágrima ou ruptura ocorre durante um experimento, a fibra deve ser descartado e os dados excluídos, embora mantendo um registro de falhas de fibra também pode ser informativa 11. Outro resultado negativo que pode ser encontrada é a activação prematura da fibra enquanto no pré-activação de solução (Figura 10C). Activação parcial na solução de pré-activação sugere contaminação cruzada bem significativa (isto é, um aumento na concentração de cálcio não intencional no pré-activação bem). Neste exemplo, todos os banhos deve ser aspirado e bem lavado com água desionizada. A secagem das superfícies divisórias entre as câmaras também é recoded como umidade ou condensação nessas áreas pode levar à absorção da solução entre banhos. A decisão de incluir ou excluir dados dependerá em última análise o foco experimental e deve, portanto, ser considerado na concepção do estudo. Figura 1: laço de sutura (10-0 monofilamento de nylon de sutura). Figura 2:. Dissecação Bundle Fórceps estão na mão esquerda, tesouras microdissection estão na mão direita. A linha vermelha indica a orientação favorável do punho e da tesoura com os eixos longitudinais das fibras. Figura 3: </strong> (A) aparelho de teste com componentes marcados. (A) câmaras experimentais com fundos transparentes. (B) Comprimento-controlador. (C) Force-transdutor. (D) fonte de luz. (E) Comprimento-controlador da unidade micrômetro xyz com display digital. (F) unidade Stage micrômetro com display digital. (G) Force-transdutor unidade xyz micrômetro. (H) Plataforma de tela alvo laser de difração calibrado. Tabela isolamento (i) da vibração. (B) Opinião do Close-up das câmaras experimentais. Superfície (j) de fixação de aço inoxidável estendendo-se desde o controlador comprimento. Superfície (k) de fixação de aço inoxidável estendendo-se desde o transdutor de força. (L) Side-view prisma. (M) Habitação para os módulos de refrigeração termoelétrica. (N) Termopar para relatar te câmaramperatura. Figura 4: Modificado 100 ponta da pipeta ul usado para transferir fibra de dissecção prato para a câmara experimental. Figura 5:. Montagem de fibra única para aparato experimental (A) Gonzos para suturas preparadas enroscada superfícies de fixação de aço inoxidável. (B) transferido para a câmara de fibra experimental. (C) A fibra ancoradas às superfícies de fixação de aço inoxidável pelo primeiro par de argolas de sutura com fio de sutura em excesso removida. (D) segundo par de alças metálicas de sutura inseridas por cima de loops primeira sutura e amarrados no lugar. <img alt="Figura 6"src = "/ files / ftp_upload / 52695 / 52695fig6.jpg" /> Figura 6: comprimento do sarcômero é avaliada pela projecção de um padrão de interferência de laser sobre uma tela de destino calibrado (a) fonte de laser.. (B) Mirror. (C) tela Target. Padrão de interferência (d) Laser. Figura 7: (a) determinação da área em corte transversal da fibra em comprimento óptimo sarcómero (humano = 2,7 uM). Assumindo uma secção transversal elíptica, a CSA é calculado para cada um dos cinco locais ao longo da fibra de secção mestra e a média das cinco medições individuais é relatado como fibra de CSA. 2a representa diâmetro e é vista de cima um eixo maior da elipse, 2b representa vista lateral de diâmetro e é o outro eixo da elipse. (B) imagens de fibras representativas que ilustram cada um dos cinco medições correspondentes diâmetro tomadas tanto na vista de topo e lateral. Figura 8: traços de força representativos do músculo vasto lateral humano saudável fibras musculares (A) Escreva uma fibra (CSA: 5710 mm 2, F o: 0,89 mN e SF o: 156 kPa).. (B) Tipo de fibra 2a (CSA: 9510 mm 2, o F: 1,66 mN e SF o: 174 kPa). Fibra miosina tipo cadeia pesada foi determinado através da utilização de separação electroforética e prata-coloração técnicas 22. oad / 52695 / 52695fig9.jpg "/> Figura 9: Cálculo da força ativa máxima (F o) (a) vista expandida de resposta vigor fibras durante o indutor de folga circulação de comprimento-controlador iniciado em solução de pré-activação.. F P é a força necessária para manter um comprimento do sarcómero 2,7 um com a fibra em repouso. (B) vista expandida de comprimento-controlador de movimento de indução de folga. Note-se que o F = F T – F P. Figura 10: deslizamento (A) laço de sutura, evidenciado por um "catch" em vigor traço durante a ascensão da força. Verifique para ter certeza de que estão seguros laços antes de ativar a fibra. (B) ruptura de fibra durante a ativação. Pode ser devido a integridade da fibra pobres ou tratamento fibra agressivo durante sutura lugar de loopmento. (C) a ativação de fibra parcial prematura devido à contaminação da câmara de pré-ativação com Ca 2+.

Discussion

As avaliações das propriedades contrácteis do músculo esquelético fibras individuais permeabilizadas são utilizados para investigar a função muscular de uma grande variedade de contextos. Exemplos incluem estudos que avaliaram os efeitos do envelhecimento 12, exercício 10,13,14, 15, voo espacial lesão 2,3,16, tratamentos de drogas 17,18, doença e 19 de manipulação genética 20,21 na estrutura e função de fibra. Devido à capacidade de avaliar directamente o desempenho contráctil de miofibrilas na sua configuração nativa, esta técnica fornece uma plataforma a partir da qual atraente para formar uma compreensão da função ausente miofibrilar de efeitos potencialmente confusão que estão presentes quando a transmissão de sinal neuromuscular e a libertação de cálcio induzida por excitação são incluídos no sistema estudado. Além disso, o teste funcional de fibras individuais podem ser usados ​​para complementar os resultados de identificação de proteína contráctil, tais como aquelesobtida por meio de imuno-histoquímica ou electroforese em gel de + 22 Western blot.

Uma das funções primárias do músculo esquelético é de gerar força. Consequentemente sF o, uma medida da capacidade de geração de força intrínseca de um sistema contráctil, é de grande interesse para os fisiologistas musculares. Estimativas fiáveis ​​do SF o exigem medidas exatas de ambos CSA fibra e F o. Como as fibras são, em geral, nem circular em secção transversal, nem uniforme no CSA longo do seu comprimento, muito cuidado deve ser tomado ao estimar CSA. Para este fim, as medições são feitas em vários locais ao longo do comprimento da fibra e, em cada local, a partir de duas perspectivas separadas por 90 °. Medidas confiáveis ​​da F o exige atenção a vários detalhes, incluindo respondendo por força passiva, ajustando comprimento do sarcômero para maximizar a sobreposição de filamentos grossos e finos, empregando uma solução de ativação com uma concentração de cálcio tchapéu resulta em activação máxima, mantendo a temperatura experimental desejado, e a manutenção das condições óptimas de armazenagem (temperatura e duração) com as fibras antes do dia da experiência.

Embora as etapas descritas aqui descrever o procedimento para avaliar força isométrica máxima, é freqüentemente desejável para avaliar outras qualidades funcionais importantes de fibras musculares esqueléticas. Isto pode ser conseguido através do alargamento do protocolo experimental para incluir manipulações mecânicas adicionais da fibra. Por exemplo, a medição da velocidade a que a fibra encurta contra uma série de diferentes cargas permite a determinação da relação força-velocidade, a partir dos quais as relações de força e de velocidade de alimentação de energia pode ser calculado 10,23,24. Além disso, a velocidade de encurtamento sem carga pode ser determinada através da utilização do "teste de folga" 25, o qual consiste em aplicar uma série de passos de encurtamento de indução de folga e measuring do tempo requerido pela fibra para remover a folga. Outro parâmetro cinética que é freqüentemente relatado é k tr, a constante de velocidade para a força de reconstrução na sequência de uma perturbação mecânica que destaca temporariamente todos pontes cruzadas 26. Por fim, a relação entre a concentração de cálcio e a geração de força activa (a "relação força-PCA") é muitas vezes de interesse 18 e pode ser determinada por exposição da fibra a uma série de soluções com concentrações que variam de cálcio abaixo do limiar de activação do contráctil sistema para aqueles suficiente para provocar a activação máxima e, portanto, a força máxima (Fo).

Embora grande parte do equipamento mencionado é necessária para avaliar a contratilidade de fibra única, outro equipamento não é absolutamente necessário. O controlador de comprimento, por exemplo, é essencial para qualquer protocolo experimental que requer alongamento rápido ou preciso, ou encurtamento da fibra,mas não é absolutamente necessário para a avaliação de força isométrica máxima (apesar de um nível de força de zero no registro vigor ainda deve ser identificado por alguns meios). Os prismas que permitem a observação da fibra a partir do lado, enquanto útil para avaliar a área em corte transversal, não são absolutamente necessárias quando o posicionamento da fibra no interior da câmara experimental. Além disso, meios alternativos para expor a fibra para as várias soluções experimentais poderia ser empregue, incluindo concepção de um sistema de accionamento manual de câmaras ou uma única câmara que permite o enchimento e esvaziamento rápidos de soluções. Finalmente, enquanto que as temperaturas experimentais sub-fisiológicas, tais como 15 ° C são normalmente utilizados para melhorar a reprodutibilidade das medições mecânicas 1,2,3,5,8,12,17,27, é possível gerar dados válidos a outras temperaturas 23 , 28, contanto que os efeitos da temperatura sobre as propriedades de solução (concentração de cálcio, pH, etc.) são tomadas em consideração. </p>

As composições das soluções de teste estão entre os aspectos mais críticos das técnicas de fibras permeabilizadas descritos aqui. Considerações sobre a composição da solução são complexas e além do escopo deste artigo. As soluções descritas no Passo 5 da secção de protocolo são concebidos com um ênfase na activação rápida da fibra permeabilizadas sobre a sua transferência desde a pré-activação de activação de soluções, mantendo uma força iónica constante, a composição catiónica, e osmolaridade 6,29. Outras abordagens para a composição da solução têm sido empregados com sucesso notável por outros grupos de pesquisa e normalmente fazem uso de constantes de ligação publicados e ferramentas computacionais 27,30,31. As concentrações de iões cálcio em várias soluções de activação é particularmente importante em estudos que envolvem a activação submáximo, tais como as avaliações força-PCA. Para as experiências em que as fibras são completamente activados, tais como os que descrevemd aqui, a concentração de cálcio na solução de activação, tipicamente excede por uma margem confortável, que requerida para atingir a força máxima, fazendo o seu conhecimento preciso menos crítica. A adição de fosfato de creatina é importante para tamponar os intramyofibrillar ATP e ADP flutuações que de outra forma seriam associadas com a actividade contráctil. A creatina-quinase é necessária para catalisar a transferência de fosfato a partir de fosfato de creatina ao ADP. Sob condições experimentais que resultam em elevadas taxas de turnover ATP, incluindo trabalho a temperaturas elevadas ou a medição de encurtamento de alta velocidade em fibras rápidas 32, creatina quinase deve ser adicionado à solução para completar o endógena de creatina quinase que permanece ligado à fibra. As condições experimentais menos exigentes, o sistema de regeneração de ATP 27 é menos crítica.

As limitações da técnica de fibra única permeabilizada incluem o seguinte. Os dados gerados por esses testes de definir opropriedades contrácteis da unidade miofibrilar específico que foi ligado ao dispositivo experimental. Por conseguinte, este capta apenas uma pequena fracção da totalidade da fibra multinucleadas partir do qual o segmento que foi obtido, por sua vez, representa uma pequena fracção do número total de fibras dentro do músculo. Os investigadores devem, portanto, considerar cuidadosamente a amostragem necessária para suportar todas as conclusões extraídas das experiências. Além disso, a avaliação do impacto de uma intervenção treinamento físico na função de fibra presume que as fibras avaliadas foram de fato recrutadas durante o treinamento. Embora o protocolo tenta imitar o meio intracelular natural da fibra, o processo de permeabilização sarcolema é não-específica e permite necessariamente constituintes intracelulares solúveis de difundir livremente em soluções de banho. Uma outra consequência da permeabilidade da membrana é uma mudança no equilíbrio osmótico evidenciado por um inchaço no volume de fibras 33. Ointumescente de fibras aumenta a distância entre os filamentos de actina e miosina, resultando em sensibilidade ao cálcio reduzida do sistema miofilamentos 34,35, mas pode ser revertida pela introdução de grandes, compostos osmoticamente activos 34. Uma limitação final a considerar é a consequência da técnica utilizada para anexar fibras para o aparelho experimental. Isso invariavelmente requer que distorcem a relação espacial dentro do sistema filamento em e perto dos pontos de fixação, com pessoas vão déficits funcionais. Especificamente, as regiões da fibra no e adjacente aos pontos de fixação estão funcionalmente comprometidas e, assim, contribuir série artefatual elasticidade ao sistema de medição.

Em resumo, descrevemos um meio pelo qual se pode avaliar a capacidade de geração de força de quimicamente permeabilizadas fibras musculares esqueléticos in vitro. Embora o foco deste artigo foi sobre a avaliação da força isométrica máxima generatincapacidade g de fibras de músculo esquelético humano, a abordagem experimental pode ser modificado e ampliado para determinar uma variedade de parâmetros cinéticos e relacionamentos em toda uma gama de espécies de mamíferos, ou de outra forma.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the following funding sources: R01-AR063649, AG-020591, F31-AR035931.

Materials

Polystyrene culture test tube with cap Fisher Scientific  14-956-3D
0.5 mL screw cap micocentrifuge Fisher Scientific  02-681-334
0.5 mL microcentrifuge caps with o-ring Fisher Scientific  02-681-358
Microcentrifuge cryobox Fisher Scientific  5055-5005
pH meter Mettler-Toledo FE20
Petri dish Fisher Scientific  08-757-11YZ
Nonsterile-suture 10-0 monofilament Ashaway Line Twine S30002
Insect pins Fine Science Tools 26002-10
Forceps – Dumont #5 Fine Science Tools 11251-20
Microdissecting scissors Fine Science Tools 15000-08
Stereo microscope Leica Microsystems MZ8
Micrometer drives Parker Hannifin 3936M
Thermometer Physitemp BAT-12
Water bath circulator  Neslab Instruments RTE-111
Temperature controller Aplha Omega Instruments Series 800
LabVIEW software National Instruments –
Computer Varied –
Chamber system Aurora Scientific 802D
Length-controller Aurora Scientific 312C
Force-transducer Aurora Scientific 403A
Reagents
K-proprionate TCI America P0510
Imadizole Sigma-Aldrich I0125
MgCl2•6H20 Sigma-Aldrich M2670
Brij 58 Sigma-Aldrich P5884
EGTA (acid) Sigma-Aldrich E0396
Na2H2ATP•0.56H2O Sigma-Aldrich A7699
Glycerol Sigma-Aldrich G6279
HEPES (acid) Sigma-Aldrich H7523
MgO Sigma-Aldrich 529699
HDTA (acid) TCI America D2019
CaCO3 Sigma-Aldrich C4830
NaN3 Sigma-Aldrich S8032
KOH (1N) Sigma-Aldrich 35113
HCL (1N) Sigma-Aldrich 318949
Na2CrP•4H2O Sigma-Aldrich P7936
pH 10 standard Fisher Scientific SB115
pH 7 standard Fisher Scientific SB107
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References

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Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers. J. Vis. Exp. (100), e52695, doi:10.3791/52695 (2015).
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