透過性に骨格筋線維によって生成される最大等尺性力の測定

動物やヒトを対象とするすべての手順は、関連するガイドライン、規制、規制当局を基準にしてください。動物の使用およびケアに関するミシガン大学委員会（UCUCA）とミシガン大学医療センター治験審査委員会は、この資料に記載されているすべての動物およびヒトの手順を承認しました。 1.解剖とストレージストック溶液を作ります注：以下の手順で指定された最終的なボリュームが拡大または縮小、必要に応じてすることができます。 千ミリリットルのビーカーに脱イオン水（ASTMタイプ1）の800ミリリットルを追加します。穏やかな撹拌を維持し、脱イオン水に、表1に記載されているすべての化合物を添加し、それらを溶解することができます。 化合物 コンクを希望します。 （M） 式重量（g /モル） 1 L（G）に追加 </ TR> K-プロピオン 0.250 112.17 28.040 イミダゾール 0.040 68.08 2.720 EGTA 0.010 380.40 3.800 のMgCl 2•6H 2 O 0.004 203.31 0.813 表1：解剖およびストレージ原液コンポーネント。 脱イオン水1,000 mlの最終容積をもたらします。それはこの時点で溶液をpHに不要であることに注意してください。 4℃での保存溶液を保管してください。 2.ストレージソリューションを作ります貯蔵溶液200mlを行うために、切開および250mlのビーカー中で貯蔵ストック溶液100mlで始まり​​ます。最終的なアデノシンをもたらすのに十分なのNa 2 H 2のATPを追加2mmの三リン酸（ATP）濃度。グリセロールで200mlの最終容量をもたらします。水酸化カリウム（KOH）でpH 7.00に調整します。 -20℃での保存液に保管してください。 注：これによりグリセロールの粘性に正確体積分配することは困難です。このため、我々は一般的に重量のグリセロールを追加（グリセロール100mlを約126グラムの重さ）。 3.ソリューションを解剖してくださいソリューションを解剖の200ミリリットルを作成するには、250mlビーカー中で解剖し、ストレージ原液100mlで始まり​​ます。 2 mMの最終ATP濃度をもたらすのに十分なのNa 2 H 2 ATPを追加します。 KOHで7.00にpHを調整します。脱イオン水で200mlに最終容量を持参してください。 -80℃で2.5ミリリットルのボリュームとストア内の一定分量。 ブリジ58でソリューションを解剖4.メイク注：ブリジ58（透過させる）脂質二重層を破壊する非イオン性界面活性剤です。 <オール> ブリジ58で溶液を解剖の200ミリリットルを作成するには、250mlビーカー内の解剖溶液200mlで始まり​​ます。穏やかな撹拌を維持し、解剖溶液にブリジ58の1グラム（w / vの0.5％）を追加し、それが溶解することができます。 -80℃で2.5ミリリットルのボリュームとストア内の一定分量。 5.試験ソリューションを作ります注：以下はMoisescuとThieleczek 1978から適合されている（6）。テストソリューションの準備の追加コメントのための議論を参照してください。 「リラックス」と表示された3つの別々の千ミリリットルビーカー、「プレ活性化」と「アクティブ化」を準備します。各ビーカーに脱イオン水400mlを追加します。 適切なビーカーに、表2に示す化合物を追加し、Cと80°〜70℃の間に解決策を加熱します。継続的に攪拌しながら30分間、70〜80℃の溶液温度を維持します。 注：elimiで70〜80℃のアシストの温度活性化溶液中のEGTAと炭酸カルシウムとの反応により形成されたカルボン酸の国家。リラックス溶液及び予備活性化溶液は、一貫性を維持するための活性化溶液と同じように扱われます。 RELAXINGソリューション PRE-活性化溶液 活性化溶液 化合物式重量（g /モル） 所望の濃度（MM） 必須のマス（G） 所望の濃度（MM） 必須のマス（G） 所望の濃度（MM） 必須のマス（G） HEPES（酸） 238.30 90.0 10.724 90.0 10.724 90.00 10.724 酸化マグネシウム 40.31 10.3 0.208 8.5 0.171 8.12 0.164 EGTA（酸） 380.40 52.0 9.890 52.00 9.890 HDTA（酸） 348.36 50.0 8.709 のCaCO 3 100.10 50.00 2.503 表2：再laxing、ソリューションコンポーネントを事前に活性化し、活性化します。 溶液を室温に冷却し、1 mMの最終のNaN 3濃度をもたらすのに十分なのNaN 3 / KOHを追加します。 注意：NaN 3を（アジ化ナトリウム）は有毒です。この化学物質を処理する前に化学MSDSを参照してください。 100 mMのアジ化ナトリウム溶液100mlを作るために、1 N KOHの10 mlにNaN 3を0.65gのを追加します。脱イオン水で100mlの最終量に調整します。 約7.10 KOHを使用してpHを調整します。 次のステップ5.4は、10 mMの最終クレアチンphosophate（CRP）濃度をもたらすために8 mmの最終ATP濃度と十分なのNa 2 CRPをもたらすのに十分なのNa 2 H 2 ATPを追加します。 脱イオン水を用いて500ミリリットルの最終容量に各溶液を持参してください。次に持ってKOHを使用し、実験が実行される温度にソリューションを冷却または加熱します7.10のpHは、その温度を維持しながら。 最終のプレ活性化溶液を500プレ活性化溶液中の溶液を弛緩1部は、予め活性化溶液を含有するビーカーに溶液を緩和加えるようになっています。 -80℃で2.5ミリリットルのボリュームとストア内の一定分量。 6.縫合糸ループを作ります非滅菌USP 10-0モノフィラメントナイロン縫合糸のストランドで始まります。 ダブルオーバーハンドノット技術を用いて鎖でループを作成するために鉗子を使用してください。約750ミクロンの直径のサイズに結び目を減らします。ループの直径は、接眼目盛マーキングを用いて顕微鏡下で評価することができます。 いずれかの側にのみループと小（500μm）の尾を残して余分な縫合糸を除去するためにmicrodissectingはさみを使用してください。完成したループの例が図1に示されています。 繰り返しは6.2から6.3まで4まで使用可能なループが行われている手順。ストアシリコーンエラストマーメッキペトルにループ私は、将来の使用のために一品。 注：フォーの縫合糸ループは、試験したすべての繊維のために必要とされます。 7.バンドルサンプル注：次の手順は、単一の繊維が最終的に抽出され、テストされるから小さい実験「バンドル」に、元のサンプルを解剖するための手順を説明します。すべての回でのサンプルは、注意して扱う必要があります。この説明の目的のために、命令は、調査者が右利きである場合として説明します。 目的のサンプルを入手し、解剖が行われる施設に転送します。 注：組織生検の方法は、実験モデルおよび試験デザインに依存して変化します。可能な場合には、筋肉の灌流は、生検の時まで維持されるべきです。 サンプルが採取部位と解剖部位との間で転送される場合、氷上に維持しながら、冷却した解剖溶液を含有するバイアルにそれを運びます。チルド解剖ソリューションと二から三昆虫の取り付けピン（直径100μm、ステンレス鋼）で5センチシリコーンエラストマーメッキペトリ皿を準備します。 皿にサンプルを転送します。サンプルは、必要に応じて複数の解剖溶液を添加することによって沈めていることを確認してください。 顕微鏡下でサンプルを検査し、研究者（ 図2）の右肩に向かって繊維の縦軸を整列させるために、それを操作します。そして、コーナー部に固定することによって皿に試料を固定します。 注：これは、サンプルを最大限に活用し、繊維の完全性を保全しますので、この時点でポイントを固定するように、残りの結合組織を使用してください。バンドルは、繊維間のマージンを規定するのを補助するためにわずかな張力で固定することができます。 左手に鉗子と右でmicrodissectingはさみで、静かに繊維間の長手方向の縁に沿ってバンドルを解剖開始注：に応じてその全長は、さらに多数の小さな束に束を分析します。 そのバンドルの寸法は幅約0.5〜1ミリメートル、長さ≥3ミリメートルを測定することを確認します。 、又は皿の下に定規を置くことによって、接眼レンズ内の目盛りマーキングと顕微鏡を使用して寸法を評価します。 解剖プロセスの結果として、鉗子またはピンによって損傷されている任意の組織を除去し、廃棄します。 バンドル十分な数の解剖やサンプルが枯渇したまでされるまでプロセスを繰り返します。 注：サイズおよび初期試料の状態、筋肉の形態、および研究者のスキルを含む多数の要因に依存する得ることができるバンドル数を。 8.透過性繊維非イオン性界面活性剤」のBrij 58 'との生鮮·冷蔵、解剖溶液2.5 mlを含有するバイアルに解剖溶液からバンドルを転送追加（0.5％、w / v）です。時折、穏やかに撹拌しながら30分間氷上でインキュベートします。バンドルは、インキュベーションを通じて沈めたままであることを確認してください。 30分のインキュベーションの終わりに、新鮮な解剖溶液（なしのBrij 58）を含むバイアルにバンドルを転送し、残り​​の界面活性剤を除去するために穏やかにかつ簡単に攪拌します。 9.ストレージにバンドルを準備冷蔵保存溶液を含むバイアルにバンドルを転送し、4℃で一晩インキュベートします。 10.ストアバンドル十分な個々の0.5mlを解剖プロセス（チューブあたり1束）の間に得られたすべてのバンドルに対応するために、キャップコニカルチューブをネジで次の日、耐えることのできる収納ボックス、-80°Cを準備します。各円錐管は、新鮮なストレージソリューションの200〜400μLで満たされるべきです。 個別に標識された円錐形のチューブにバンドルを転送します。バンドルがに固定されていないことを確認してください円錐管の側面又は溶液の表面に浮遊。コニカルチューブに蓋をし、試験の日まで-80℃で試料を保存します。 11.実験装置を準備します注：カスタム装置は長制御と力変換器、移動チャンバー方式と10Xの解剖顕微鏡を収容する段階で構成されています。マイクロメータ·ドライブのインストールは、ファイバ取付面の正確な操作を可能に。レーザー回折パターンは、サルコメア長さを推定するために使用されます。実験中に生成されたデータは、パーソナルコンピュータに記録されます。実験設定の注釈付きの画像について、図3を参照してください。 1バイアルリラックス、プレ活性化し、活性化溶液のそれぞれを解凍し、氷上に維持します。 ATPとCRPは低温に維持されるべきである不安定な化合物であることに注意してください。 使用するための顕微鏡、試験装置および関連するコンピュータを準備します。 </li> リラックスした溶液を用いた最初の実験室を埋めます。我々の装置では、第一室は、研究者は、サイドからの繊維を撮影することを可能にするプリズムが含まれています。予備活性化溶液およびソリューションを活性化する第3と第二の実験室を埋めます。 チャンバ内の温度計の表示が15℃を読み取るように温度を調整します。スレッド2準備縫合糸は、力変換器と長さコントローラ（ 図5A）の両方から延びるステンレス鋼取付面にループします。 12.エキス透過性に単繊維興味のある繊維束を解凍し、新鮮な、冷却リラックス溶液とシリコーンエラストマーメッキペトリ皿に移します。どちらかの端にピンとバンドルを確保し、それが水没していることを確認してください。 ピンセットを使用して、一方の端部でファイバを把持し、その長手方向軸に沿ってスムーズに抽出始めます。 注：に圧縮損傷を鉗子によって生じるファイバの端部は、この領域の収縮特性がテストされませんので、この時点では問題ではありません。繊維と細胞外マトリックスとの間の癒着が過度の緊張をもたらす可能性があるため、最終的にするためにストレッチ誘発損傷をリードし、バンドルからの繊維を抽出する場合には注意が、しかし、注意しなければなりません。かなりの変動は繊維が周囲の細胞外マトリックスに付着する程度の筋肉の間に存在することに注意してください。このようなストレッチによって損傷されていることが疑われている繊維は、廃棄されるべきです。 （ 図4）に示すように、ピペットチップを変更するには、かみそりの刃またはメスを使用してください。ソリューションをリラックス少量と共に先端に繊維を導入します。リラックスしたソリューションが含まれている実験室にシリコーンエラストマーメッキペトリ皿から単繊維を転送します。 13.マウント単繊維注：ステップバイステップdepicti上の図5に見ることができます。 ピンセットでやさしく案内、ピペットチップから繊維を除去し、第1の縫合糸ループを使用して長さコントローラ（左）に固着。 ピンセットでループを締めるときに、単一の、滑らかな動きを使用してください。等しく逆張力が縫合糸の両端に印加されていることを確認します。 最初のループは、長さコントローラ取付面の端から2mmと1mm程度を接続する必要があります。 力変換器に向かって光ファイバのもう一方の端を操作する（右）と同じ手順を使用して繊維を固定します。 microdissectingはさみ（ 図5C）を使用して、過剰な縫合糸を取り除きます。 x座標マイクロドライブ（ 図3A）を用いて、長さコントローラと力変換器アーム間の距離を増加させることによってテンション少量の下に繊維を配置します。 最初の上に第2のループを通し、繊維を固定力変換器取付面の端0.2mMの内の点（ 図5D）で。 microdissectingはさみを使って余分な縫合糸を取り除きます。 ファイバ取付プロセスは、チャンバからの溶液の損失をもたらすことができます。必要に応じて、溶液の表面が平坦（いずれも凹面にも凸）であることを確認するために、よりリラックスしたソリューションを追加します。レーザー回折を使用して筋節の長さを評価する際に平坦な表面が重要です。 y軸方向の長さ、コントローラの位置を調整することにより、実験室の側壁に繊維を平行に合わせます。 プリズム側面図を用いた繊維を調査し、繊維が室の床と平行になるまで、z軸方向の長さ、コントローラの位置を調整します。 ファイバの一方の端部に第着目して、チャンバの床に平行な繊維の位置は、チャンバプリズムことなく達成することができ、T：注意顕微鏡のフォーカスを調整することなく、鶏、そのz軸マイクロドライブを使用して焦点に光ファイバのもう一方の端を持って来ます。 繊維は実装工程の結果として、曲げられたねじれたまたは損傷したどのような方法であれば、繊維は廃棄されるべきであり、新たな繊維が取り付けられています。 14.設定の最適サルコメアの長さファイバが正しくチャンバー内に整列された場合には、顕微鏡の前面に較正されたターゲットスクリーンを挿入し、最初の実験室の上の位置に合わせます。 注：ターゲット画面は、標準的な回折格子の式を用いて較正され、λ= SLのsinθと、SLはサルコメア長であり、θは0°と1°回折ビームとλの間の回折角は、レーザの波長です。 レーザーをオンにして、レーザはファイバの中心を通過するように、ステージの位置を調整します。 注意：集中レーザー光がTにダメージを与えることができます視力O。レーザーがオンのときに顕微鏡で繊維を可視化しようとしないでください。 レーザー光を回折し、校正し、ターゲット画面（ 図6）に干渉パタパタを観察するために、レーザービームに対して繊維を置きます。より明確にこのパターンを可視化するためにライトをオフにします。 注：レーザビームの正確な位置決めと、干渉パターンが見られない場合、これは繊維の筋原繊維の成分は異常な/破損していることを示唆している繊維は、新鮮なものと交換する必要があること。 回折光の所望の間隔は、ターゲット画面上で観察されるまで、筋節の長さを設定するために、長コントローラX軸マイクロドライブを使用して、繊維の張力を増加または減少させます。 注：繊維の最適なサルコメア長は試料が得られた動物の種類に依存するであろう。 2.7ミクロンのサルコメア長は、一般的に時ロバ最適であることが想定されますヒト組織7,8からの繊維を歌います。 最適なサルコメア長が設定された後、2つの最も内側の縫合糸の間の距離を測定します。これは、最も簡単に、チャンバのx軸の動きを制御するマイクロドライブ上のデジタル読み出しを使用して達成されます。接眼レンズの垂直方向の十字線が最も内側の縫合糸の最も内側の境界線上に整列されるように、室を置き、マイクロメータードライブ上のデジタル表示をゼロ。 他の最も内側の縫合糸に達するまで顕微鏡にx軸に沿った相対的なステージを翻訳。デジタル表示は、繊維の長さを示します。この値は、ファイバ長、L fとして記録されるべきです。 注：これは、2つの最も内側の縫合糸との間の距離が評価される収縮性組織の機能的な長さを決定することが理解されるべきです。研究者は、この内の寸法（ すなわち、LのF）の一貫性のために努力すべきです一連の実験。 15.見積もり断面積（CSA） L fの繊維を維持し、トップとサイドビューの両方からの繊維の中央部の高倍率画像をキャプチャするために、顕微鏡に取り付けられたカメラを使用しています。サイドビュー画像は、チャンバの側面に埋め込まれたプリズムを用いて捕捉することができます。 注意：上部と側面図の間の移行時には、2つの画像が「レジスタ」であり、従って、繊維の同部分の2つの異なるビューを表示することを確実にするためにだけy方向に顕微鏡を移動させることが重要です。 調査の後の絶対的な力を正規化するために、この時点で測定値を得ます。これらの測定値を得るための技術は、後述する図7Aおよび図7Bに示されています。 16.引き出す等尺性収縮注：データは、これらの実験の間に生成するがSを回収し、力応答の取得、表示、保存、および分析のために有利であることができるコンピュータソフトウエアを使用せずに解釈することができます。私たちの研究室によって作成されたカスタムLabVIEWソフトウェアは、これらの機能だけでなく、能力が実験中に、長さ、コントローラのアクションを支配する「モーション列車」を設計することができます。 リラックス、プレ活性化し、活性化溶液の温度が15℃で安定していることを確認してください。 予備活性化溶液を含むチャンバに繊維を移動し、3分間そこインキュベートするチャンバ制御ソフトウェアを使用してください。 注：事前に活性化溶液が弱く活性化溶液への繊維の導入の際に、非常に迅速な活性化及び力開発の結果、のCa 2+のためにバッファリングされています。 10秒前活性化溶液とL fで維持ファイバ長内に残存すると、ゼロFOを確立実験レコード内のRCEレベル。 注：長さコントローラの「検索力ゼロ」運動がゼロの力に対応する力変換器レベル（ すなわち繊維が簡単に動きの結果として弛みとなる）を明らかにする。パッシブ力は、ゼロとトランスデューサゼロ化運動の直前に力レベルとの差です。 3分の終了時に、活性化溶液を含むチャンバに繊維を移動し、急速な上昇が先行する力の高原によって証明されるように、最大​​等尺力を開発することができます。 最大等尺力に達した後、活性化溶液を含むチャンバ内にゼロの力に対応する力変換器出力を識別するために、長さ·コントローラーを使用しています。 注：ゼロの力に対応する力変換器の出力は、一般的には、各溶液が充填されたチャンバのために異なるため、これが必要です。 第2の力の達成次のPLateau、リラックス溶液を含むチャンバに繊維を返します。テストが完了しました。いずれか1つのセッション吸引中にすべてのソリューションを複数のファイバをテストし、新しい、冷却ソリューションを追加します。 注：長期間にわたって最大の収縮を誘発する際にブレンナーのサイクリングプロトコルが考慮されるべきです。このプロトコルは、最大活性化ファイバ9の構造と機械的特性を保存することが示されています。