Mesure de la force maximale isométrique généré par perméabilisées fibres du muscle squelettique

Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ou humains doivent être effectuées conformément aux directives et règlements pertinents, et les organismes de réglementation. L'Université du Michigan Comité sur l'utilisation et aux soins des animaux (UCUCA) et l'Université de Conseil d'examen du Michigan Medical Center institutionnel approuvé l'ensemble des animaux et des procédures humaines décrites dans cet article. 1. Assurez-dissection et stockage Stock Solution Remarque: Les volumes finales spécifiées dans les instructions suivantes peuvent être agrandies ou réduites comme souhaité. Dans un bécher de 1000 ml, ajouter 800 ml d'eau déminéralisée (ASTM Type 1). Le maintien d'un bruit doux, ajouter tous les composés énumérés dans le tableau 1 à l'eau déminéralisée et leur permettre de se dissolvent. Composé Désiré Conc. (M) Formule Poids (g / mol) Ajouter à 1 L (g) </ Tr> K-propionate 0,250 112.17 28,040 Imidazole 0,040 68.08 2.720 EGTA 0,010 380,40 3.800 MgCl 2 • 6H 2 O 0,004 203,31 0,813 Tableau 1: Dissection et stockage solution stock composants. Porter à un volume final de 1000 ml avec de l'eau désionisée. A noter qu'il n'y a pas lieu à un pH de la solution à ce stade. Conserver la solution d'achat d'actions à 4 ° C. 2. Assurez solution de stockage Pour faire 200 ml de solution de stockage, de commencer avec 100 ml de disséquer et de la solution de stockage de valeurs d'un bécher de 250 ml. Ajouter suffisante Na 2 H 2 ATP pour apporter adénosine finaletriphosphate (ATP) à la concentration de 2 mM. Porter à un volume final de 200 ml avec du glycérol. Ajuster le pH à 7,00 avec de l'hydroxyde de potassium (KOH). Conserver la solution de stockage à -20 ° C. Remarque: En raison de la nature visqueuse de glycérol il peut être difficile de se passer précisément en volume. Pour cette raison, on ajoute typiquement le glycerol en poids (par 100 ml de glycérol pèse environ 126 g). 3. Assurez-dissection Solution Pour faire 200 ml de solution de dissection, de commencer avec 100 ml de la solution de dissection et le stockage dans un bécher de 250 ml. Ajouter suffisamment de Na 2 H 2 ATP pour amener la concentration finale d'ATP à 2 mM. Ajuster le pH à 7,00 avec du KOH. Amener le volume final à 200 ml avec de l'eau désionisée. Aliquote dans des volumes de 2,5 ml et conserver à -80 ° C. 4. Faire dissection Solution avec Brij 58 Remarque: Brij 58 est un détergent non-ionique qui perturbe (perméabilise) bicouches lipidiques. <ol> Pour faire 200 ml de solution avec Brij 58 dissection, commencer avec 200 ml de la solution de dissection dans un bécher de 250 ml. Le maintien d'un bruit doux, ajouter 1 g de Brij 58 (0,5% p / v) à la solution de dissection et de le laisser se dissoudre. Aliquote dans des volumes de 2,5 ml et conserver à -80 ° C. 5. Assurez-Testing Solutions Remarque: Ce qui suit est une adaptation de Moisescu et Thieleczek 1978 (6). Voir Discussion pour des commentaires supplémentaires sur la préparation de solutions de test. Préparer trois béchers séparés 1.000 ml étiquetés "relaxant", "pré-activation" et "Activer". Ajouter 400 ml d'eau déminéralisée dans chaque bêcher. Ajouter les composés indiqués dans le Tableau 2 dans le bêcher approprié, puis à chauffer la solution entre 70 ° C et 80 ° C. Maintenir une température de solution de 70-80 ° C pendant 30 min en remuant sans cesse. Note: Une température de 70-80 ° C passes dans le elimination de l'acide carbonique formé par la réaction de carbonate de calcium avec EGTA dans la solution d'activation. Les solutions de détente et de la solution de pré-activation sont traités de la même manière que la solution d'activation pour maintenir la cohérence. SOLUTION DE DÉTENTE PRE-ACTIVATING SOLUTION Solution d'activation Composé Formule Poids (g / mol) Concentration désiré (mM) Mass requis (g) Concentration désiré (mM) Mass requis (g) Concentration désiré (mM) Mass requis (g) HEPES (acide) 238.30 90,0 10,724 90,0 10,724 90.00 10,724 MgO 40.31 10.3 0,208 8.5 0,171 8.12 0,164 EGTA (acide) 380,40 52,0 9.890 52.00 9.890 HDTA (acide) 348,36 50,0 8,709 CaCO 3 100.10 50.00 2.503 Tableau 2: Rele relâchement, la pré-activation et activation composants de la solution. Refroidir la solution jusqu'à la température ambiante et ajouter suffisamment de NaN 3 / KOH pour amener la concentration finale de NaN3 à 1 mM. ATTENTION: NaN 3 (azoture de sodium) est toxique. Reportez-vous à la fiche signalétique chimiques avant de manipuler ce produit chimique. Pour 100 ml de solution d'azide de sodium 100 mM, ajouter 0,65 g de NaN 3 à 10 ml de KOH 1 N. Ajuster à un volume final de 100 ml avec de l'eau désionisée. Ajuster le pH à environ 7,10 en utilisant KOH. Suite à l'étape 5.4 ajouter suffisamment de Na 2 H 2 ATP pour amener la concentration finale d'ATP à 8 mM et Na 2 CrP suffisante pour amener le phosophate finale de la créatine (CRP) de concentration de 10 mM. Amener chaque solution au volume final de 500 ml avec de l'eau désionisée. Réfrigérer ou chauffer les solutions à la température à laquelle expériences seront réalisées, puis utilisez KOH d'apporterle pH à 7,10, tout en maintenant cette température. Ajouter la solution dans le bécher contenant la solution de pré-activation de détente telles que la solution finale de pré-activation est une partie de solution dans 500 solution de pré-activation de détente. Aliquote dans des volumes de 2,5 ml et conserver à -80 ° C. 6. Assurez-suture Loops Commencez avec un brin de non stérile USP 10-0 monofilament en nylon suture. Utilisez la pince pour créer une boucle avec le brin en utilisant la technique de nœud double. Réduire le nœud en taille à environ 750 um de diamètre. diamètre de la boucle peut être évaluée sous le microscope utilisant des marquages ​​oculaire du réticule. Utilisez microdissecting ciseaux pour enlever l'excès de suture ne laissant que la boucle et de petite taille (500 um) queues de chaque côté. Un exemple d'une boucle finie est représentée sur la figure 1. Répétez les étapes 6.2-6.3 jusqu'à 4 boucles utilisables ont été faites. Magasin boucles dans un élastomère de silicone plaqué petri plat pour une utilisation future. Remarque: Quatre boucles de suture sont requises pour chaque fibre testée. 7. Bundle échantillon Remarque: Les étapes suivantes décrivent la procédure pour disséquer l'échantillon original en petits «paquets» expérimentaux à partir de laquelle des fibres individuelles seront finalement extraits et testés. En tout temps, l'échantillon doit être traité avec soin. Aux fins de cette description, des instructions seront données comme si l'enquêteur est droitier. Obtenir l'échantillon d'intérêt et de le transférer à l'établissement où aura lieu la dissection. Remarque: Les méthodes de biopsie tissulaire varieront selon le modèle expérimental et conception de l'étude. Lorsque cela est possible, la perfusion du muscle devrait être maintenue jusqu'au moment de la biopsie. Si l'échantillon doit être transféré entre le site de la récolte et le site de dissection, le transporter dans un flacon contenant une solution de dissection froide tout en étant maintenu sur de la glace. Préparer une boîte de Pétri de 5 cm élastomère de silicone plaqué avec une solution glacée de dissection et deux à trois broches de montage d'insectes (100 um de diamètre, en acier inoxydable). Transférer l'échantillon à l'antenne. Assurez-vous que l'échantillon reste immergé en ajoutant plus de solution de dissection si nécessaire. Inspecter l'échantillon sous le microscope et le manipuler à aligner les axes longitudinaux des fibres vers l'épaule droite de l'enquêteur (Figure 2). Ensuite, l'échantillon à ancrer la capsule par goupillage dans les coins. Remarque: Assurez-utilisation de tout tissu conjonctif restant comme des points d'ancrage à ce moment puisque ce sera de maximiser l'utilisation de l'échantillon et de conserver l'intégrité de la fibre. Le faisceau peut être épinglé dans une légère tension pour aider à définir les marges inter-fibres. Avec la pince à la main gauche et les ciseaux microdissecting dans le droit, commencer à disséquer délicatement un faisceau le long des marges longitudinales entre les fibres Note: En fonction de sonlongueur totale, disséquer davantage le paquet en plusieurs petits paquets. Assurez-vous que les dimensions des faisceaux mesurent environ 0,5-1 mm de largeur et ≥3 mm de longueur. Évaluer les dimensions à l'aide d'un microscope avec des marques de réticule dans l'oculaire, ou en plaçant une règle sous la parabole. Enlever et jeter tout tissu qui a été endommagé par des pinces ou des épingles à la suite du processus de dissection. Répétez le processus jusqu'à ce qu'un nombre suffisant de paquets ont été disséqués ou jusqu'à ce que l'échantillon a été épuisé. Note: Le nombre de faisceaux que l'on peut obtenir dépend de nombreux facteurs, notamment la taille et l'état de l'échantillon initial, la morphologie du muscle, et l'homme de l'investigateur. 8. Fibres perméabilisent Transférez les faisceaux de la solution de dissection dans un flacon contenant 2,5 ml de fraîches, réfrigérées, solution, disséquant avec le détergent non-ionique "Brij 58 'ajoutée(0,5%, p / v). Incuber sur de la glace pendant 30 min avec de temps en temps, une agitation douce. Veiller à ce que les faisceaux restent immergés dans toute incubation. À la fin de l'incubation de 30 min, transférer les paquets dans un flacon contenant une solution de dissection frais (pas de Brij 58) et agiter doucement et brièvement pour enlever tout résidu de détergent. 9. Préparer Bundles pour le stockage Transférer les paquets à un flacon contenant une solution de stockage réfrigéré et incuber une nuit à 4 ° C. 10. Magasin Bundles Le lendemain, préparer une boîte de stockage, capable de résister à -80 ° C, avec suffisamment individuels 0,5 ml à vis des tubes coniques de capitalisation pour accueillir tous les faisceaux obtenus au cours du processus de dissection (un paquet par tube). Chaque tube conique doit être rempli avec 200-400 pi de solution de stockage frais. Transférer les paquets dans les tubes coniques étiquetés individuellement. Assurez-vous que le faisceau ne soit pas collée àle côté du tube ou flottant à la surface de la solution conique. Boucher les tubes coniques et conserver les échantillons à -80 ° C jusqu'au jour de l'essai. 11. Préparer appareil expérimental Remarque: L'appareil personnalisé est composé d'un étage qui abrite un dispositif de commande de capteur de longueur et de force, un système de déplacement et une chambre dissection microscope 10X. installations d'entraînement micrométrique permettent une manipulation précise des surfaces de fixation de la fibre. Motifs de diffraction laser sont utilisés pour estimer la longueur de sarcomère. Les données générées lors de l'expérimentation sont enregistrées sur un ordinateur personnel. Reportez-vous à la figure 3 pour les images annotées de l'expérimental. Décongelez un flacon chacun des pré-activation de détente et de solutions d'activation et de maintenir sur la glace. Notez que l'ATP et la CRP sont des composés labiles qui devraient être maintenus à des températures froides. Préparer le microscope, appareil de test et l'ordinateur associé à l'emploi. </li> Remplissez la première chambre expérimentale avec une solution de détente. Dans notre appareil, la première chambre contient des prismes qui permettent à l'investigateur de photographier la fibre par le côté. Remplir la deuxième chambre avec la solution expérimentale de pré-activation et le troisième avec une solution d'activation. Réglez la température de sorte que l'affichage en chambre thermomètre indique 15 ° C. Discussion deux boucles de suture préparés sur les surfaces de fixation en acier inoxydable étendant à la fois du transducteur de force et de durée de commande (figure 5A). 12. Extrait perméabilisées fibre unique Décongeler un faisceau de fibres d'intérêt, et de les transférer à une boîte de Pétri élastomère de silicone plaqué avec des produits frais, réfrigérés solution de détente. Fixer le faisceau avec des broches à chaque extrémité et assurez-vous qu'il est submergé. Utilisation de la pince, saisir une fibre à une extrémité, et commencer à extraire en douceur le long de son axe longitudinal. Remarque: les dommages à la compression à laextrémité de la fibre provoquée par la pince est pas un problème à l'heure actuelle puisque les propriétés contractiles dans ce domaine ne seront pas testées. Des précautions doivent toutefois être prises lors de l'extraction des fibres du faisceau depuis adhérences entre les fibres et la matrice extracellulaire peuvent entraîner une tension excessive, conduisant finalement dommages à étirer-induite. Notez que il existe une variabilité considérable entre les muscles de la mesure dans laquelle les fibres adhèrent à la matrice extracellulaire avoisinante. Fibres qui sont soupçonnés d'avoir été endommagé par un tel tronçon devraient être jetés. Utilisez une lame de rasoir ou un scalpel pour modifier une pipette comme le montre la (figure 4). Introduire la fibre dans l'embout avec une petite quantité de solution de détente. Transférer la fibre unique à partir de la boîte de Pétri élastomère de silicone plaqué à la chambre expérimentale qui contient la solution de détente. 13. Monter fibre unique Remarque: Un depicti étape par étapepeut être consulté sur la figure 5. Guider délicatement avec une pince, retirer la fibre de la pointe de la pipette et l'ancrer à la longueur-contrôleur (gauche) en utilisant la première boucle de suture. Utilisez un seul mouvement en douceur lors du serrage de la boucle avec la pince. Assurez-vous que une tension égale et opposée est appliquée à chaque extrémité de la suture. La première boucle doit être attachée autour de 1 mm à 2 mm de l'extrémité de la surface de fixation de longueur de commande. Manipuler l'autre extrémité de la fibre vers le transducteur de force (à droite) et de sécuriser la fibre en utilisant la même procédure. Enlever l'excès de suture à l'aide des ciseaux de microdissecting (Figure 5C). Placer la fibre sous une faible quantité de tension en augmentant la distance entre les bras de longueur et de contrôleur de transducteur de force à l'aide de la coordonnée x d'entraînement micrométrique (figure 3A). Enfiler la deuxième boucle sur le premier et ancrer la fibreà un point en moins de 0,2 mm de l'extrémité de la surface de fixation de force de transducteur (Figure 5D). Enlever l'excès de suture à l'aide des ciseaux de microdissecting. Le procédé de fixation de fibre peut entraîner la perte de solution de la chambre. Si nécessaire, ajouter la solution de plus relaxant pour assurer la surface de la solution est plat (ni concave ni convexe). Une surface plane est important lors de l'évaluation longueur de sarcomère par diffraction laser. Aligner la fibre parallèlement aux parois latérales de la chambre expérimentale en ajustant la position de la longueur-contrôleur dans la direction de l'axe des y. Enquête sur la fibre en utilisant la vue prisme de côté et ajuster la position de la longueur-contrôleur dans la direction de l'axe z jusqu'à ce que la fibre est parallèle au sol de la chambre. Note: positionnement de la fibre parallèlement à l'étage de la chambre peut être réalisé sans prismes de la chambre en se focalisant sur une première extrémité de la fibre et tpoule, sans réglage de la mise au point du microscope, ce qui porte l'autre extrémité de la fibre dans le foyer à l'aide de son entraînement micromètre axe z. Si la fibre est de toute façon tordu, tordu ou endommagé à la suite du processus de montage, la fibre doit être jeté et fixé une nouvelle fibre. 14. Set Optimal Sarcomère Longueur Lorsque la fibre a été correctement aligné dans la chambre, insérez l'écran cible calibré sur la face antérieure du microscope et de l'aligner sur la première chambre expérimentale. Remarque: L'écran cible est calibré en utilisant l'équation de type standard, λ = SL sin, où SL est la longueur de sarcomère, θ est l'angle de diffraction entre 0 ° et 1 ° faisceaux diffractés et λ est la longueur d'onde du laser. Allumer le laser et ajuster la position de la platine de telle sorte que le laser passe par le centre de la fibre. ATTENTION: concentré de lumière laser peut être endommager to vue. Ne jamais tenter de visualiser la fibre à travers le microscope lorsque le laser est allumé. Placez la fibre par rapport au faisceau laser pour diffracter la lumière laser et d'observer un bagout d'interférence sur l'écran cible calibré (figure 6). Éteignez les lumières de visualiser ce modèle plus clairement. Remarque: Si, avec le positionnement correct du faisceau laser, aucun motif d'interférence est considérée, ce qui suggère que les composants de la fibre myofibrillaires sont anormaux / endommagé et que la fibre doit être remplacée par une nouvelle. Pour définir le sarcomère longueur, augmenter ou diminuer la tension sur la fibre en utilisant l'axe-x micromètre entraînement longueur du contrôleur jusqu'à ce que l'espacement souhaité de la lumière diffractée est observé sur l'écran cible. Remarque: La longueur de sarcomère optimale de la fibre dépendra de l'espèce animale à partir de laquelle on a obtenu l'échantillon. Une longueur de sarcomère de 2,7 um est communément supposé être optimale lorsque âneschanter fibres de 7,8 de tissus humains. Après optimale longueur de sarcomère a été défini, mesurer la distance entre les deux points de suture plus intimes. Ceci est le plus facilement accompli en utilisant la lecture numérique sur le disque micrométrique qui contrôle le mouvement de l'axe des x de la chambre. Positionner la chambre de telle sorte que les cheveux transversale verticale de l'oculaire est alignée sur la bordure la plus interne de la suture la plus interne et la lecture numérique zéro sur l'unité de micromètre. Traduire la scène le long de l'axe des x par rapport au microscope jusqu'à ce qu'il atteigne l'autre plus à l'intérieur suture. L'affichage numérique indique la longueur de la fibre. Cette valeur doit être enregistrée comme la longueur des fibres, L f. Remarque: Il doit être entendu que la distance entre les deux sutures les plus internes déterminera la longueur fonctionnelle du tissu contractile en cours d'évaluation. L'enquêteur devrait viser la cohérence dans cette dimension (c.-L f) dans unsérie d'expériences. 15. estimation transversale Area (CSA) Maintenir la fibre à L f et utiliser l'appareil photo de microscope monté pour capturer une image à fort grossissement de la partie centrale de la fibre à la fois le haut et de côté. Vue latérale images peuvent être capturées en utilisant le prisme intégré dans le côté de la chambre. Remarque: Lors du passage entre le haut et des vues de côté, il est important de se déplacer seulement le microscope dans la direction y pour que les deux images sont "dans le registre" et par conséquent montrent deux vues différentes de la même section de la fibre. Obtenir des mesures en ce moment à normaliser force absolue plus tard dans l'étude. Les techniques d'obtention de ces mesures sont décrites plus loin et illustrés sur les figures 7A et 7B. 16. Susciter isométrique Contraction Remarque: Bien que les données générées lors de ces expériencess peuvent être collectées et interprétées sans l'utilisation d'un ordinateur, un logiciel qui permet l'acquisition, affichage, le stockage et l'analyse des réponses de force est avantageux. Le logiciel LabVIEW personnalisé créé par notre laboratoire permet à ces fonctions ainsi que la capacité de concevoir des «trains de mouvement 'qui régissent l'action de la longueur contrôleur pendant une expérience. Vérifiez que la température de la détente, de pré-activation et solutions d'activation sont stables à 15 ° C. Utilisez le logiciel de contrôle de la chambre pour déplacer la fibre à la chambre contenant la solution de pré-activation et incuber là pour 3 min. Remarque: La solution de pré-activation est faiblement tamponnée de Ca2 +, ce qui entraîne une activation et la force du développement très rapide lors de l'introduction de la fibre de la solution d'activation. Avec 10 sec restant dans la solution de pré-activation et la longueur de fibre maintenu à L f, établir un zéro foniveau de rce dans l'enregistrement expérimental. Remarque: Le mouvement «Trouver Zero Force 'de la longueur contrôleur révèle le niveau transducteur de force qui correspond à la force de zéro (c.-à-la fibre devient brièvement mou à la suite du mouvement). Force passive est la différence entre zéro et que le niveau de force juste avant le mouvement du transducteur à zéro. A la fin de la 3 min, déplacer la fibre à la chambre contenant la solution d'activation et force isométrique maximale permet de développer en évidence par un plateau de force qui est précédée d'une montée rapide. Après avoir atteint la force isométrique maximale, en utilisant la longueur contrôleur pour identifier la sortie transducteur de force qui correspond à une force nulle dans la chambre contenant la solution d'activation. Note: Ceci est nécessaire parce que la sortie transducteur de force qui correspond à une force nulle est en général différente pour chaque chambre de solution-remplie. Après avoir atteint une deuxième force plateau, retourner la fibre à la chambre contenant la solution de détente. Le test est maintenant terminée. Pour tester plusieurs fibres au cours de toute aspiration d'une séance toutes les solutions et ajouter de nouvelles solutions, réfrigérés. Remarque: les protocoles de cyclisme Brenner devraient être pris en considération lors susciter contractions maximales sur une période de temps prolongée. Ce protocole a été établi pour conserver les propriétés structurelles et mécaniques dans la fibre au maximum neuf activé.