Basitleştirilmiş İnsan Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET) İzolasyon ve Taşıma
Summary
Aşağıdaki protokol, piyasada kolayca bulunabilen ayıraçları kullanarak, insan tüm kanından Nötrofil Ekstrasellüler tuzakları (NET) izole etmek için çok basit bir şekilde tarif eder. Daha sonra izole edilmiş NET'ler kanser hücreleri bir in vitro yapışma deneyinde kullanılabilir gösterilmektedir.
Abstract
Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET) son zamanlarda nötrofil en antimikrobiyal araçlara parçası olarak tespit edilmiştir. Apart enfeksiyonları mücadele onların rolü, son araştırmalar da kanser ilerlemesi de dahil olmak üzere diğer birçok hastalık süreçlerinde, yer olabileceğini göstermiştir. Arıtılmış Nets Yalıtımlı bu fonksiyonların çalışma izin çok önemli bir unsurdur.
Bu video, piyasada kolayca bulunabilen ayıraçları kullanarak, insan tüm kanından hücresiz .NET izolasyon basit bir yöntem ortaya koymaktadır. İzole NET'ler sonra immünofloresan boyama, kurutma veya çeşitli fonksiyonel deneyleri için de kullanılabilir. Bu nötrofillerin kendileri potansiyel karıştırıcı etkileri yokluğunda onların biyolojik özelliklerinin değerlendirilmesini sağlar.
Bir yoğunluk gradyan ayırma tekniği sağlıklı donor bütün kandan nötrofilleri izole etmek için kullanılır. İzole edilmiş nötrofiller sonra forbol 12-myr tarafından uyarılıriState 13-asetat (PMA) NETosis tetiklemek için karıştırılabilir. Aktive edilen nötrofiller, daha sonra atılır ve hücre içermeyen bir .NET hazır elde edilir.
Daha sonra A549 insan akciğer kanser hücreleri ile bir yapışma deneyinde kullanılabilir nasıl izole NET'ler göstermektedir. NET hazır kat ilave edilir, 96 gözlü bir hücre kültürü plakası O / N, ve çukurlara altındaki uygun bir .NET tek tabaka oluşumuna katkıda sonra CFSE etiketli A549 hücrelerinin kuyu kullanılır. Yapışık hücreler Nikon TE300 floresan mikroskop kullanılarak değerlendirilmiştir edilir. Bazı kuyularda, 1000U DNAse1 Nets aşağılamak için saymadan önce 10 dakika ilave edilir
Introduction
Nötrofil hücre dışı trans (NET) yeni protein ve histon yüzlerce edilmiş hücre dışı DNA kordonlarından teşekkül nötrofil türevi elemanların keşfedilir. Onlar belirli uyaranlara aşağıdaki enfeksiyon ve inflamasyon bağlamında nötrofiller tarafından salgılanan ve onlar başlangıçta enfeksiyonlara karşı nötrofil savunma mekanizmalarının bir parçası olarak kabul edilmiştir. İlk bakteriler, virüsler ve mantarlar 1-3 dahil olmak üzere çeşitli mikrobik işgalciler yakalama teşvik gösterilmiştir. Mikrop Yakalama sonra kendi yıkımına hem doğrudan NET-ilişkili proteinler 3,4 ile ve dolaylı fagositik hücrelerin 5,6 yerel istihdam yoluyla yol açacak. NET'ler rolü ancak savunma barındırmak için sınırlı görünmüyor. Daha yakın zamanda, bu, 9 trombozu, otoimmün hastalıklar 7,8 önemli bir rol oynadığı için, gebelik ile ilgili bozukluklar 10 ve hatta kanser ilerlemesinin gösterilmiştir11,12. Bu duruma göre, bu NET'ler çeşitli fizyolojik süreçlerin bir çok sayıda çok önemli bir rol oynar gibi görünmektedir. Ancak, bu tür araştırmaların yeni doğası göz önüne alındığında, çok NET'ler etkilerini gösterirler hangi mekanizmalar ile ilgili olarak aydınlatılamamıştır gerekmektedir. Burada, nötrofillerin yokluğunda NET'ler izolasyonu için basit bir yöntem sunulmaktadır.
Aşağıdaki videoda, insan tam kandan Nets izole etmek basitleştirilmiş ve kolay bir tekniği göstermek. Hücresiz NET'ler daha sonra yapışma, çoğalma ve yer değiştirme gibi bir takım tahlillerin yanısıra kurutma, boyama, imuunofluorescence da dahil olmak üzere, in vitro deneylerde, bir dizi kullanılabilir. Diğer protokoller ancak onlar genelde, uzun, karmaşık, pahalı ve sık sık, düşük verim 13 olan, 13, 19 var. Bu basitleştirilmiş protokol nedenle procedu uzunluğunu minimize, temel reaktifler kullanır ve nötrofillerin izole etmek için gerekli adımların sayısını azaltırverimi en üst düzeye çıkarırken yeniden.
Aşağıdaki yöntem, nötrofil izolasyonu için farklı teknikler, daha önce, canlı nötrofil çok saf bir örnek elde edildi basit bir protokol elde etmek için literatürde tarif edilen bir araya getirir. Literatürde önerildiği gibi, venöz kan EDTA tüplerde toplandı ve nötrofil aktivasyonunu 14 önlemek için 10 dakika içinde kullanılır. Bu heparinize tam kan, ilk boyum ve ark 15 ile tarif Ficoll yoğunluk santrifüj tekniği adapte edilmiş bir metot ile ilgili granülositleri ve kırmızı kan hücreleri izole etmek için, Limfosit Ayırma Ortamı (LSM), yoğunluk gradyanlı santrifüj kullanır. LSM sodyum metrizoat sodyum Diatrizoate yerine ve nötrofillerin 16-18 izole etmek birçok çalışmada başarıyla kullanılmaktadır Boyum formülasyonun bir değişiklik.
Farklı yoğunluklu santrifüjleme, monositler ve lenfositler atılır tarafta; kırmızı kan hücreleri daha sonra çöktürülür% 6 Dekstran çözeltisi 14 kullanılarak ve kalan kırmızı kan Tripan mavisi ve metilen mavisi boyaması ile kontrol edilir saf nötrofil, bir popülasyon elde etmek için eritilir.
Çok sayıda maddeler lipopolisakarit (LPS) ve forbol miristat asetat (PMA) ve interlökinler (IL-8), 3,5,6 de dahil olmak üzere, in vitro ve in vivo olarak NETosis uyarılması için kullanılmıştır. Aşağıdaki protokol, izole edilmiş nötrofiller apoptozu 19,20 teşvik etmeden, tutarlı ve güvenilir bir .NET oluşumuna imkan vermek üzere yeterli bir konsantrasyonu gösterilmiştir 4 saat için 500 nM PMA ile uyarılır.
Izole edildikten sonra, bu protokolden elde edilen hücre içermeyen NET'ler bir yapışma deneyinde kullanılabilir gösterilmektedir. DNAse1 sindirilmesi ve daha önce tarif edildiği gibi ağları ile indirgeme için kullanılır ve bu nedenle, bir kontrol 2,3,11 olarak hizmet eder. Diğer seçenekler NET Formatı inhibe etmek için Nötrofil elastaz inhibitörü (NEi) kullanımını içeriramaç NET oluşumunu inhibe ziyade bozulmasını 11 gerçekleştirmek için kabul edilebilir bir alternatif olan, üzerinde. NEi çeşitli fonksiyonları bir dizi olmasına rağmen, daha önce NET yerleştirme kromatin yoğunlaşması, nükleer degranülasyonunu ve nötrofıl ölüm 12 blokajı yoluyla NEi ile inhibe edilebilir olduğu gösterilmiştir
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu videoda gösterildiği Nötrofil Ekstrasellüler Tuzak izolasyon protokolü nötrofil izolasyonu ve NET oluşumu için literatürde kullanılan farklı teknikler birleştirir. Bu oldukça karmaşık ve değişken sürecini basitleştiren ve diğer protokoller daha az adımlarla saflaştırılmış hücre-serbest Nets izole etmek çok güvenilir ve tekrarlanabilir bir yol sunar. Ayrıca, hazır reaktifler protokolleri basitlik ekleyerek istihdam edilmekte ve önemli ölçüde maliyetini azaltmak. statik yapışma dene…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Wisent | 311-425-CL | |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | Wisent | 305-010-CL | |
| Dextran hydrochloride (powder) | Spectrum | DE130 | 6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | 3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum |
| BD Pharm Lyse Lysing buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Alrdrich | P8139 | |
| DNAse1 | Roche | 11284932001 | |
| F12 DMEM | Wisent | 319-075-CL | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Integrid tissue culture dish with 20mm grid (150 x 25mm) | Falcon | 353025 |
References
- Saitoh, T., et al. Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1. Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).
- Bruns, S., et al. Production of extracellular traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin RodA. PLoS Pathog. 6 (4), e1000873 (2010).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Papayannopoulos, V., Zychlinsky, A. NETs: a new strategy for using old weapons. Trends Immunol. 30 (11), 513-521 (2009).
- McDonald, B., Urrutia, R., Yipp, B. G., Jenne, C. N., Kubes, P. Intravascular neutrophil extracellular traps capture bacteria from the bloodstream during sepsis. Cell Host Microbe. 12 (3), 324-333 (2012).
- Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. J Immunol. 185 (12), 7413-7425 (2010).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. J Immunol. 187 (1), 538-552 (2011).
- Khandpur, R., et al. NETs are a source of citrullinated autoantigens and stimulate inflammatory responses in rheumatoid arthritis. Sci Transl Med. 5 (178), 178ra140 (2013).
- Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13076-13081 (2012).
- Hahn, S., Giaglis, S., Hoesli, I., Hasler, P. Neutrophil NETs in reproduction: from infertility to preeclampsia and the possibility of fetal loss. Front Immunol. 3, 362 (2012).
- Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. J Clin Invest. , (2013).
- Cools-Lartigue, J., Spicer, J., Najmeh, S., Ferri, L. Neutrophil extracellular traps in cancer progression. Cell Mol Life Sci. , (2014).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. J Vis Exp. (36), (2010).
- Maqbool, M., Vidyadaran, S., George, E., Ramasamy, R. Optimisation of laboratory procedures for isolating human peripheral blood derived neutrophils. Med J Malaysia. 66 (4), 296-299 (2011).
- Boyum, A. Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Scand J Immunol. Suppl. 5, 9-15 (1976).
- Calado, R. T., et al. Sex hormones, acting on the TERT gene, increase telomerase activity in human primary hematopoietic cells. Blood. 114 (11), 2236-2243 (2009).
- Zhong, C., Qu, X., Tan, M., Meng, Y. G., Ferrara, N. Characterization and regulation of bv8 in human blood cells. Clin Cancer Res. 15 (8), 2675-2684 (2009).
- Wu, Y. J., et al. In vivo leukocyte labeling with intravenous ferumoxides/protamine sulfate complex and in vitro characterization for cellular magnetic resonance imaging. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (5), C1698-C1708 (2007).
- Saffarzadeh, M., et al. Neutrophil extracellular traps directly induce epithelial and endothelial cell death: a predominant role of histones. PLoS One. 7 (2), e32366 (2012).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
