Упрощенный нейтрофилов человека Внеклеточные Ловушки (НРТ) Изоляция и регулировать

Нейтрофилов внеклеточных ловушек (НРТ) недавно обнаружили элементы нейтрофилов, полученных состоящие из нитей внеклеточной ДНК, украшенный сотнями белков и гистонов. Они вырабатываются нейтрофилов в контексте инфекции и воспаления следующие конкретные стимулы, и они были первоначально признаны как часть нейтрофилов в защитных механизмов против инфекции. Они были впервые показаны в целях содействия захвата различных микробных захватчиков в том числе бактерий, вирусов и грибков ^1-3. Захват микроба бы затем привести к его разрушению как непосредственно Net-ассоциированных белков ^3,4 и косвенно, через местной основе фагоцитирующих клеток ^5,6. Роль сетей, однако, похоже, не ограничивается иммунной защиты. Совсем недавно, они, как было показано, играют важную роль в аутоиммунных заболеваний ^7,8, тромбоз ^9, связанных с беременностью расстройств ¹⁰ и даже прогрессирование рака^11,12. Соответственно, очевидно, что НРТ играют важную роль в большом количестве различных физиологических процессах. Однако, учитывая роман характер таких исследований, многое еще предстоит выяснить в отношении механизмов, посредством которых НРТ проявляют свое действие. Здесь мы представляем упрощенный метод для изоляции сетей при отсутствии нейтрофилов.

В следующем видео мы демонстрируем Простота и удобство технику, чтобы изолировать сетей с помощью цельной крови человека. Бесклеточные НРТ затем могут быть использованы в ряде экспериментов в пробирке в том числе окрашивание, imuunofluorescence, блоттинга, а также ряда анализов, таких как адгезии, пролиферации и миграции. Существуют и другие протоколы, ^{13, 19,} тем не менее, они, как правило, длительный, сложный, дорогостоящий, и часто, низкий выход ^13. Этот упрощенный протокол использует основные реагенты и уменьшает количество шагов, необходимых для выделения нейтрофилов, следовательно, свести к минимуму длину процедуры, применяемыеRe при максимальном урожай.

Следующий метод сочетает в себе различные методы для выделения нейтрофилов ранее описаны в литературе, чтобы получить простой протокол получая очень чистый образец живых нейтрофилов. Как было предложено в литературе, венозной крови собирают в пробирки с ЭДТА и использовать в течение 10 мин, чтобы избежать активации нейтрофилов ^14. Мы используем лимфоцитов раздела сред (МНК) центрифугирования в градиенте плотности для выделения гранулоциты и эритроциты из гепаринизированной цельной крови, способу приспособленного с техникой плотности Ficoll центрифугированием первоначально описанной Boyum и др ^15. LSM является модификация состава Boyum, который замещает диатризоат натрия для metrizoate натрия и успешно используется во многих исследованиях, чтобы изолировать нейтрофилы ^16-18.

После дифференциального центрифугирования в градиенте плотности, моноциты и лимфоциты отбрасываются; красные кровяные клетки затем осаждаютс использованием 6% -ного раствора декстрана ^14, а остальные эритроциты лизируют, чтобы получить население чистой нейтрофилов, что проверяется с трипанового синего и метиленовый синий окрашивания.

Многочисленные агенты были использованы для индуцирования NETosis как в пробирке и в естественных условиях, в том числе липополисахарида (LPS), а также форболмиристатацетата (РМА) и интерлейкины (IL-8) ^3,5,6. В следующем протоколе, изолированные нейтрофилы стимулировали 500 нМ ФМА в течение 4 ч, который, как было показано, чтобы быть адекватной концентрации, чтобы обеспечить постоянное и надежное формирование чистого, не способствуя апоптозу ^19,20.

После выделения, показано, как бесклеточных НРТ, полученные из этого протокола могут быть использованы в анализе адгезии. DNAse1 используется, чтобы переварить и ухудшает сетей не как описано выше, и, таким образом, служит в качестве контроля ^2,3,11. Другие варианты включают в себя использование ингибитора эластазы нейтрофилов (Nei) ингибировать NET formatiна, который является приемлемой альтернативой, когда цель заключается в ингибировании формирование чистого, а не производить их деградации ^11. Хотя NEi имеет ряд различных функций, ранее было показано, что NET осаждения может быть запрещена по Неи через блокирование хроматина деконденсации, ядерной дегрануляции и нейтрофилов смерти ¹²