簡体ヒト好中球細胞外トラップ（のNET）の単離と取扱い

好中球細胞外トラップ（のNET）タンパク質とヒストンの何百によって装飾された外DNAの鎖から構成される新たに発見された好中球由来の要素です。これらは、特定の刺激後の感染および炎症の文脈における好中球によって分泌され、それらが最初に感染に対する好中球の防御機構の一部であることが認められた。これらは、最初の細菌、ウイルスおよび真菌^1-3を含む種々の微生物の侵入者の捕獲を促進することが示された。微生物の捕捉することは、両方の直接NET関連タンパク質^3,4及び間接的に食細胞^5,6の地元の募集を通じてによってその破壊につながる。のNETの役割は、しかし、防衛をホストするために制限されていないようです。より最近では、彼らは、自己免疫疾患^7,8、血栓^9、妊娠関連障害^10、さらに癌の進行において重要な役割を果たすことが示されている^11,12。したがって、NETは、多様な生理学的プロセス、多数の重要な役割を果たしていると思われる。しかしながら、このような研究の新規な性質を考えると、多くのNETは、それらの効果を発揮するメカニズムについて解明されていない。ここで、我々は、好中球の不在内のネットの単離のための簡便法を提示する。

次のビデオでは、我々は、ヒト全血からのNETを単離するために簡略化され、容易な技術を実証する。無細胞のNETは、次いで、接着、増殖および遊走のような多くのアッセイならびにブロッティング、染色、imuunofluorescence含むインビトロの実験で使用することができる。他のプロトコルは、しかし、彼らは通常、長い複雑な、高価な、そして多くの場合、低い収率¹³である^、13、19が存在する。この簡略化されたプロトコルは、基本的な試薬を使用し、好中球を単離するために必要なステップの数が減少するので。手順の長さを最小化する収量を最大化しながら、再。

以下の方法は、好中球の単離のための別の技術は、以前に生きた好中球の非常に純粋な試料を得た単純なプロトコルを得るために、文献に記載され組み合わせる。文献で ​​示唆したように、静脈血をEDTAチューブに回収し、好中球活性化^14を回避するために10分以内に使用されている。我々は、ヘパリン化全血、最初にBoyumら¹⁵によって記載され、フィコール密度遠心分離技術から適応方法から顆粒球および赤血球を分離するためにリンパ球分離培地（LSM）密度勾配遠心分離を使用する。 LSMナトリウムピリオドンのためのジアトリゾ酸ナトリウムを代入し、好中^16-18を単離するために多くの研究において成功裏に使用されてきたBoyum製剤の変形例である。

差動密度遠心分離後、単球およびリンパ球は廃棄される。赤血球は、次いで沈降さ6％デキストラン溶液^14を使用して、残りのRBCをトリパンブルーおよびメチレンブルー染色によって確認された純粋な好中球の集団を得るために溶解される。

多くの物質は、リポ多糖（LPS）、および酢酸ミリスチン酸ホルボール（PMA）およびインターロイキン^{（IL-8）-3,5,6-}含む、 インビトロおよびインビボの両方NETosisを誘導するために使用されてきた。以下のプロトコールでは、単離された好中球はアポトーシス^19,20を促進することなく一貫した信頼NET形成を可能にするのに十分な濃度であることが示されている4時間、500 nMのPMAで刺激する。

単離後、我々は、このプロトコルから得られた無細胞のNETは、接着アッセイにおいて使用することができる方法を示す。 DNAse1で消化し ​​、前述のようにのNETを分解するために使用されるので、制御^2,3,11として機能する。他のオプションはNET formatiを阻害する好中球エラスターゼ阻害剤（NEI）の使用を含むこれ、上の目標は、NET形成を阻害するのではなく、それらの分解^11を達成するためにあるときに許容可能な代替手段です。 NEIが変化多数の機能を有するが、それは以前にNET堆積が、クロマチン脱凝縮、核の脱顆粒及び好中球の死¹²の閉塞を通してNEIによって阻害され得ることが示されている