פשוטה מלכודות תאיות נויטרופילים אדם בידוד (רשתות) וטיפול
Summary
בפרוטוקול הבא, אנו מתארים דרך פשוטה מאוד לבודד את מלכודות נויטרופילים תאיות (רשתות) מכל דם אנושי באמצעות ריאגנטים זמינים. לאחר מכן, אנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש ברשתות המבודדות בassay הידבקות במבחנה עם תאים סרטניים.
Abstract
מלכודות נויטרופילים התאיות (רשתות) זוהו לאחרונה כחלק מארסנל מיקרוביאלית של נויטרופילים. מלבד תפקידם במלחמה בזיהומים, מחקר שנעשה לאחרונה הראה כי הם עשויים להיות מעורבים בתהליכים רבים מחלה אחרות, ובכלל זה התקדמות הסרטן. בידוד רשתות מטוהרים הוא אלמנט חיוני כדי לאפשר המחקר של פונקציות אלה.
בסרטון הזה, אנחנו מדגימים שיטה פשוטה של בידוד NET תא מתוך כל דם אנושי באמצעות ריאגנטים זמינים. רשתות מבודדות לאחר מכן ניתן להשתמש עבור מכתים immunofluorescence, סופג או מבחני תפקודיים שונים. זה מאפשר הערכה של הנכסים הביולוגיים שלהם בהעדר תופעות של בלבול הפוטנציאליות של נויטרופילים עצמם.
טכניקת הפרדת שיפוע צפיפות מועסקת לבודד נויטרופילים מכל דם תורם בריא. אז נויטרופילים מבודדים מומרצים ע"י phorbol 12 myr13-אצטט istate (PMA) כדי לגרום לNETosis. אז נויטרופילים הופעל מבוטלים, ומניית NET-תא ללא מתקבלת.
לאחר מכן, אנו מדגימים כיצד מבודדים רשתות ניתן להשתמש בassay הידבקות עם תאי סרטן הריאות אנושיים A549. מניית NET משמשת למעייל הבארות של 96 O צלחת תרבית תאים היטב / תאי A549 N, ולאחר הבטחת היווצרות monolayer NET נאותה בחלק התחתון של הבארות, שכותרתו CFSE מתווספות. תאים חסיד הם לכמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי Nikon TE300. בחלק מהבארות, 1000U DNAse1 מתווסף 10 דקות לפני הספירה להשפיל רשתות
Introduction
מלכודות תאי נויטרופילים (רשתות) הם שהתגלו לאחרונה אלמנטים הנגזרים נויטרופילים מורכבים מגדילי הדנ"א תאי מעוצבים על ידי מאות חלבונים וההיסטונים. הם מופרשים על ידי נויטרופילים בהקשר של זיהום ודלקת בעקבות גירויים מסוימים והם הוכרו בתחילה להיות חלק ממנגנוני ההגנה של נויטרופילים מפני זיהומים. הם הוצגו לראשונה לקידום לכידה של פולשים חיידקים שונים, כוללים חיידקים, וירוסים ופטריות 1-3. לכידתו של החיידק היה אז להוביל להרס שלו הן באופן ישיר על ידי החלבונים הקשורים NET 3,4 ובעקיפין באמצעות גיוס המקומי של תאי phagocytic 5,6. התפקיד של רשתות עם זאת נראה שלא יהיה מוגבל לארח הגנה. לאחרונה, הם הוכחו לשחק תפקיד חשוב במחלות אוטואימוניות 7,8, פקקת 9, הפרעות הקשורות להריון 10 ואפילו התקדמות הסרטן11,12. בהתאם לכך, נראה כי רשתות לשחק תפקיד חשוב במספר רב של תהליכים פיסיולוגיים שונים. עם זאת, בהתחשב באופי החדשני של מחקר כזה, הרבה עדיין לא הובהר לגבי המנגנונים שבאמצעותם רשתות להפעיל את השפעתם. במסמך זה, אנו מציגים שיטה פשוטה לבידוד של רשתות בהעדר של נויטרופילים.
בסרטון הבא, אנחנו מדגימים טכניקה פשוטה וקלה לבודד את רשתות מכל דם אנושי. רשתות תא ללא לאחר מכן ניתן להשתמש במספר הניסויים במבחנה הכולל צביעה, imuunofluorescence, סופגות, כמו גם מספר מבחני כגון הידבקות, הפצה והגירה. פרוטוקולים אחרים קיימים 13, 19, אולם הם בדרך כלל ארוכים, מורכבים, יקרים, ולעתים קרובות, תשואה נמוכה 13. פרוטוקול זה משתמש בחומרים כימיים פשוט בסיסיים ומפחית את מספר הצעדים הנדרשים כדי לבודד נויטרופילים, ולכן צמצום האורך של proceduמחדש תוך מיקסום תשואה.
השיטה הבאה משלבת טכניקות שונות לבידוד נויטרופילים שתוארו קודם לכן בספרות להשיג פרוטוקול פשוט מניב מדגם טהור מאוד של נויטרופילים חיים. כפי שהוצע בספרות, דם ורידים נאסף בצינורות EDTA בשימוש בתוך 10 דקות, כדי למנוע הפעלת נויטרופילים 14. אנו משתמשים בצנטריפוגה מדיה הפרדת השיפוע (LSM) צפיפות ימפוציטים לבודד גרנולוציטים ותאי דם אדומים מהדם כל heparinized, שיטה המותאמת מטכניקת צנטריפוגה צפיפות Ficoll תחילה שתוארה על ידי Boyum et al 15. LSM הוא שינוי של ניסוח Boyum שמחליף diatrizoate נתרן לmetrizoate נתרן ושמש בהצלחה במחקרים רבים לבודד נויטרופילים 16-18.
בעקבות צנטריפוגה צפיפות ההפרש, מונוציטים ולימפוציטים מבוטלים; לאחר מכן תאי דם אדומים משקעיםבאמצעות 6% פתרון Dextran 14 וRBCs הנותרים lysed להשיג אוכלוסייה של נויטרופילים הטהורים, אשר מאומת עם Trypan כחול וכתמי כחולים מתילן.
סוכנים רבים שנעשו שימוש כדי לגרום NETosis הן במבחנה in vivo, כוללים lipopolysaccharide (LPS), ותצטט myristate phorbol (PMA) וinterleukins (IL-8) 3,5,6. בפרוטוקול הבא, נויטרופילים המבודדים מומרצים עם 500 ננומטר PMA במשך 4 שעות, אשר הוכח להיות ריכוז נאות כדי לאפשר היווצרות NET עקבית ואמינה ללא קידום אפופטוזיס 19,20.
לאחר בידוד, אנו מדגימים כיצד רשתות תא ללא שהתקבלו מפרוטוקול זה יכול לשמש בassay הידבקות. DNAse1 משמש לעיכול ולבזות רשתות כפי שתואר לעיל ובכך משמש כשליטה 2,3,11. אפשרויות אחרות כוללות את השימוש במעכבי elastase נויטרופילים (ניי) לעכב formati NETב, אשר מהווה חלופה מקובלת כאשר המטרה היא לעכב את היווצרות NET ולא תשפיע שפלתם 11. למרות שניי יש מספר הפונקציות מגוונות, זה כבר הראה בעבר כי בתצהיר NET יכול להיות מעוכב על ידי ניי באמצעות חסימה של decondensation הכרומטין, degranulation הגרעיני ומות נויטרופילים 12
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול בידוד מלכודת נויטרופילים התאי הפגין בסרטון זה משלב טכניקות שונות המשמשות בספרות לבידוד נויטרופילים והיווצרות NET. זה מפשט את תהליך מורכב למדי ומשתנה ומציע דרך אמינה מאוד ושכפול לבודד את רשתות תא ללא מטוהרים עם פחות שלבים מאשר פרוטוקולים אחרים. יתר על כן, חומ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Wisent | 311-425-CL | |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | Wisent | 305-010-CL | |
| Dextran hydrochloride (powder) | Spectrum | DE130 | 6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | 3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum |
| BD Pharm Lyse Lysing buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Alrdrich | P8139 | |
| DNAse1 | Roche | 11284932001 | |
| F12 DMEM | Wisent | 319-075-CL | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Integrid tissue culture dish with 20mm grid (150 x 25mm) | Falcon | 353025 |
References
- Saitoh, T., et al. Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1. Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).
- Bruns, S., et al. Production of extracellular traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin RodA. PLoS Pathog. 6 (4), e1000873 (2010).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Papayannopoulos, V., Zychlinsky, A. NETs: a new strategy for using old weapons. Trends Immunol. 30 (11), 513-521 (2009).
- McDonald, B., Urrutia, R., Yipp, B. G., Jenne, C. N., Kubes, P. Intravascular neutrophil extracellular traps capture bacteria from the bloodstream during sepsis. Cell Host Microbe. 12 (3), 324-333 (2012).
- Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. J Immunol. 185 (12), 7413-7425 (2010).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. J Immunol. 187 (1), 538-552 (2011).
- Khandpur, R., et al. NETs are a source of citrullinated autoantigens and stimulate inflammatory responses in rheumatoid arthritis. Sci Transl Med. 5 (178), 178ra140 (2013).
- Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13076-13081 (2012).
- Hahn, S., Giaglis, S., Hoesli, I., Hasler, P. Neutrophil NETs in reproduction: from infertility to preeclampsia and the possibility of fetal loss. Front Immunol. 3, 362 (2012).
- Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. J Clin Invest. , (2013).
- Cools-Lartigue, J., Spicer, J., Najmeh, S., Ferri, L. Neutrophil extracellular traps in cancer progression. Cell Mol Life Sci. , (2014).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. J Vis Exp. (36), (2010).
- Maqbool, M., Vidyadaran, S., George, E., Ramasamy, R. Optimisation of laboratory procedures for isolating human peripheral blood derived neutrophils. Med J Malaysia. 66 (4), 296-299 (2011).
- Boyum, A. Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Scand J Immunol. Suppl. 5, 9-15 (1976).
- Calado, R. T., et al. Sex hormones, acting on the TERT gene, increase telomerase activity in human primary hematopoietic cells. Blood. 114 (11), 2236-2243 (2009).
- Zhong, C., Qu, X., Tan, M., Meng, Y. G., Ferrara, N. Characterization and regulation of bv8 in human blood cells. Clin Cancer Res. 15 (8), 2675-2684 (2009).
- Wu, Y. J., et al. In vivo leukocyte labeling with intravenous ferumoxides/protamine sulfate complex and in vitro characterization for cellular magnetic resonance imaging. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (5), C1698-C1708 (2007).
- Saffarzadeh, M., et al. Neutrophil extracellular traps directly induce epithelial and endothelial cell death: a predominant role of histones. PLoS One. 7 (2), e32366 (2012).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
