Simplifié droits de neutrophiles extracellulaires Piège (NET) Isolement et Manipulation

Pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) sont nouvellement découvert des éléments de neutrophiles dérivés composées de brins d'ADN extracellulaire décorées par des centaines de protéines et les histones. Elles sont sécrétées par les neutrophiles dans le contexte de l'infection et l'inflammation suivants stimuli spécifiques et ils ont été comptabilisés initialement faire partie des mécanismes de défense de l'neutrophiles contre les infections. Ils ont d'abord été présentés à promouvoir le piégeage de divers envahisseurs microbiens tels que les bactéries, virus et champignons ^1-3. Le piégeage du microbe serait alors conduire à sa destruction à la fois directement par les protéines de NET-associé ^3,4 et indirectement par le recrutement local des cellules phagocytaires ^5,6. Le rôle des filets ne semble toutefois pas être limité à défense de l'hôte. Plus récemment, ils ont été montré à jouer un rôle important dans les maladies auto-immunes ^{7,8, 9} thrombose, des troubles liés à la grossesse ¹⁰ et même la progression du cancer^11,12. En conséquence, il apparaît que les filets jouent un rôle important dans un grand nombre de divers processus physiologiques. Toutefois, étant donné le roman nature de ces recherches, il reste beaucoup à élucider ce qui concerne les mécanismes par lesquels NET exercent leurs effets. Ici, nous présentons une méthode simplifiée pour l'isolement de NET en l'absence de neutrophiles.

Dans la vidéo suivante, nous démontrons une technique simplifiée et facile à isoler NET au sang total humain. NET sans cellules peuvent ensuite être utilisés dans un certain nombre d'expériences in vitro, y compris coloration, imuunofluorescence, effaçant ainsi que d'un certain nombre d'analyses telles que l'adhérence, la prolifération et la migration. D'autres protocoles existent ^{13, 19,} mais ils sont généralement long, complexe, coûteux, et souvent, faible rendement ^13. Ce protocole simplifié utilise des réactifs de base et diminue le nombre d'étapes nécessaires pour isoler les neutrophiles, ce qui réduit donc la longueur du procre tout en maximisant le rendement.

Procédé suivant combine différentes techniques pour l'isolement des neutrophiles décrits précédemment dans la littérature pour obtenir un protocole simple qui donne un échantillon très pur de neutrophiles vivants. Comme suggéré dans la littérature, le sang veineux est recueilli dans des tubes EDTA et utilisé dans les 10 minutes pour éviter l'activation des neutrophiles ^14. Nous utilisons des médias de séparation de lymphocytes (LSM) centrifugation en gradient de densité pour isoler les granulocytes et les globules rouges à partir de sang entier héparinisé, une méthode adaptée de la technique de centrifugation par densité de Ficoll initialement décrite par Boyum ¹⁵ et al. LSM est une modification de la formulation Boyum qui substitue le diatrizoate de sodium pour le métrizoate de sodium et a été utilisé avec succès dans de nombreuses études pour isoler les neutrophiles ^16-18.

Après centrifugation différentielle de densité, les monocytes et les lymphocytes sont rejetés; les globules rouges sont ensuite sédimentéesen utilisant une solution de dextrane à 6% et ¹⁴ les globules rouges restants sont lysées pour obtenir une population de neutrophiles purs, ce qui est vérifié au bleu Trypan et une coloration au bleu de méthylène.

De nombreux agents ont été utilisés pour induire NETosis la fois in vitro et in vivo, y compris un lipopolysaccharide (LPS) et de l'acétate myristate de phorbol (PMA) et les interleukines (IL-8) ^3,5,6. Dans le protocole suivant, les neutrophiles isolés sont stimulés avec 500 nM de PMA pendant 4 h, ce qui a été montré être une concentration suffisante pour permettre la formation NET cohérente et fiable sans favoriser l'apoptose ^19,20.

Après isolement, nous montrons comment NET sans cellules obtenues à partir de ce protocole peuvent être utilisés dans un test d'adhérence. DNAse1 est utilisé pour digérer et dégrader NET comme décrit précédemment et sert de témoin ^2,3,11 ainsi. D'autres options incluent l'utilisation d'un inhibiteur de l'élastase neutrophile (IEN) pour inhiber formati NETsur, qui est une alternative acceptable lorsque l'objectif est d'inhiber la formation NET plutôt que de réaliser leur dégradation ^11. Bien NEi a un certain nombre de fonctions variées, il a été précédemment montré que le dépôt NET peut être inhibée par NEi par blocage de la décondensation de la chromatine, la dégranulation des neutrophiles nucléaire et la mort ¹²