المبسطة الإنسان الفخاخ خارج الخلية العدلات (المستجدة) عزل والمناولة
Summary
في بروتوكول التالية، ونحن تصف طريقة بسيطة جدا لعزل الفخاخ خارج الخلية العدلات (المستجدة) من الدم الكامل البشري باستخدام الكواشف متاحة بسهولة. نحن ثم إظهار كيف يمكن استخدام شبكات معزولة في المختبر في التصاق مقايسة مع الخلايا السرطانية.
Abstract
الفخاخ خارج الخلية العدلات (المستجدة) تم تحديدها مؤخرا كجزء من عتاد المضادة للميكروبات والعدلة و. وبصرف النظر عن دورهم في محاربة الالتهابات، وقد أثبتت البحوث التي أجريت مؤخرا أنها قد تشارك في العديد من العمليات أمراض أخرى، بما في ذلك تطور السرطان. عزل المستجدة تنقية يشكل عنصرا حاسما للسماح دراسة هذه الوظائف.
في هذا الفيديو، ونحن لشرح طريقة مبسطة من خلية NET المجانية بمعزل عن الدم كله البشري باستخدام الكواشف متاحة بسهولة. ويمكن بعد ذلك المستجدة المعزولة أن تستخدم لتلطيخ المناعي، النشاف أو مختلف المقايسات الفنية. وهذا يتيح إجراء تقييم لخصائصها البيولوجية في غياب آثار الخلط المحتملة العدلات أنفسهم.
ويعمل كثافة تقنية فصل التدرج لعزل العدلات من متبرع سليم الدم الكامل. ثم يتم تحفيز العدلات معزولة من قبل phorbol 12 MYRistate 13-خلات (PMA) للحث على NETosis. ثم يتم التخلص منها العدلات المنشط، ويتم الحصول على صافي الأسهم خالية من الخلايا.
نحن بعد ذلك شرح كيفية المستجدة معزولة يمكن استخدامها في مقايسة التصاق مع خلايا سرطان الرئة A549 الإنسان. يتم استخدام الأسهم NET إلى معطف الآبار من 96 بئر زراعة الخلايا لوحة O / N، وبعد ضمان تشكيل أحادي الطبقة NET كاف على الجزء السفلي من الآبار، وصفت CFSE الخلايا A549 تضاف. الخلايا الملتصقة وكميا باستخدام مجهر فلوري نيكون TE300. في بعض الآبار، يضاف 1000U DNAse1 10 دقيقة قبل عد أن تتحلل المستجدة
Introduction
الفخاخ خارج الخلية العدلات (المستجدة) التي يتم اكتشافها حديثا العناصر المستمدة من العدلات تتكون من خيوط من الحمض النووي خارج الخلية زينت بها المئات من البروتينات والهستونات. ويفرز من قبل العدلات في سياق العدوى والالتهابات التالية منبهات محددة وكانوا مبدئيا أن تكون جزءا من آليات الدفاع في العدلات ضد الالتهابات. وظهر لأول مرة لتعزيز محاصرة من مختلف الميكروبات الغازية بما في ذلك البكتيريا والفيروسات والفطريات 1-3. سوف محاصرة من الميكروب ثم تؤدي إلى تدميرها بشكل مباشر عن طريق البروتينات المرتبطة NET 3،4 وبشكل غير مباشر من خلال التوظيف المحلي من الخلايا البلعمية 5،6. ولكن لا يبدو أن دور شبكات تقتصر على استضافة الدفاع. وفي الآونة الأخيرة، فقد ثبت أنها تلعب دورا مهما في أمراض المناعة الذاتية 7،8، 9 الجلطة، واضطرابات مرتبطة بالحمل 10 وحتى تطور سرطان11،12. وفقا لذلك، يبدو أن المستجدة تلعب دورا هاما في عدد كبير من العمليات الفسيولوجية المختلفة. ومع ذلك، نظرا لطبيعة الرواية من هذه البحوث، لا يزال هناك الكثير ليتم توضيح فيما يتعلق الآليات التي المستجدة تمارس تأثيراتها. هنا، نقدم طريقة مبسطة لعزل الشباك في غياب العدلات.
في الفيديو التالي، ونحن لشرح تقنية مبسطة وسهلة لعزل المستجدة من الدم الكامل البشري. ويمكن بعد ذلك المستجدة خالية من الخلايا يمكن استخدامها في عدد من التجارب في المختبر بما في ذلك تلطيخ، imuunofluorescence، النشاف وكذلك عدد من فحوصات مثل التصاق، والانتشار والهجرة. غيرها من البروتوكولات وجود 13 و 19، إلا أنها عادة ما تكون طويلة ومعقدة، ومكلفة، وغالبا، العائد المنخفض 13. يستخدم هذا البروتوكول المبسط الكواشف الأساسية ويقلل من عدد من الخطوات المطلوبة لعزل العدلات، وبالتالي التقليل من طول proceduإعادة مع تعظيم العائد.
يجمع بين الأسلوب التالي تقنيات مختلفة لالعدلات العزلة وصف سابقا في الأدب للحصول على بروتوكول بسيط مما أسفر عن عينة نقية جدا من العدلات الحية. كما اقترح في الأدب، ويتم جمع الدم الوريدي في أنابيب EDTA واستخدامها في غضون 10 دقيقة لتجنب تفعيل العدلات 14. نحن نستخدم الخلايا الليمفاوية فصل وسائل الإعلام (LSM) التدرج الكثافة الطرد المركزي لعزل المحببة وخلايا الدم الحمراء من الدم الكامل heparinized، وهي طريقة مقتبسة من Ficoll تقنية الكثافة الطرد المركزي وصفها في البداية من قبل Boyum وآخرون 15. LSM هو تعديل للصياغة Boyum أن يستبدل دياتريزوات الصوديوم لمتريزوات الصوديوم واستخدمت بنجاح في العديد من الدراسات لعزل العدلات 16-18.
وبعد كثافة التفاضلية الطرد المركزي، وتجاهل وحيدات الخلايا اللمفية. والرسوبية خلايا الدم الحمراء ثمباستخدام 6٪ ديكستران حل 14 وهي lysed في كرات الدم الحمراء المتبقية للحصول على سكان العدلات النقية، والتي يتم التحقق منها مع التريبان الأزرق والميثيلين الأزرق تلطيخ.
وقد استخدمت العديد من وكلاء للحث على NETosis سواء في التجارب المختبرية والحية، بما في ذلك lipopolysaccharide في (LPS)، وphorbol ميريستات خلات (PMA) والمحفزة (IL-8) 3،5،6. في بروتوكول التالية، يتم تحفيز العدلات معزولة مع 500 نيوتن متر سلطة النقد الفلسطينية لمدة 4 ساعة، وهو ما ثبت أن يكون تركيز كاف للسماح NET تشكيل ثابت وموثوق بها من دون تعزيز موت الخلايا المبرمج 19،20.
بعد العزلة، وعلينا أن نظهر كيف يمكن استخدام الناموسيات خالية من الخلايا التي تم الحصول عليها من هذا البروتوكول في مقايسة التصاق. يستخدم DNAse1 الهضم وتتحلل المستجدة كما هو موضح سابقا، ويعمل كعنصر تحكم 2،3،11 الآن. وتشمل الخيارات الأخرى استخدام العدلات الإيلاستاز المانع (ني) لمنع NET formatiعلى الذي هو بديل مقبول عندما يكون الهدف هو لمنع تشكيل NET بدلا من إحداث تدهورها 11. وعلى الرغم من ني لديها عدد من الوظائف المتنوعة، فقد ثبت سابقا أن صافي ترسب يمكن مستعمل من قبل نيي من خلال انسداد decondensation لونين، تحبب النووي والعدلة وفاة 12
Protocol
Representative Results
Discussion
وخارج الخلية العدلات بروتوكول فخ العزلة موضح في هذا الفيديو يجمع بين التقنيات المختلفة المستخدمة في الأدب لعزل العدلات وتشكيل NET. انه يبسط عملية معقدة إلى حد ما ومتغيرة، ويقدم وسيلة موثوق بها للغاية وقابلة للتكرار لعزل تنقية المستجدة خالية من الخلايا مع خطوات أقل من…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Wisent | 311-425-CL | |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | Wisent | 305-010-CL | |
| Dextran hydrochloride (powder) | Spectrum | DE130 | 6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | 3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum |
| BD Pharm Lyse Lysing buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Alrdrich | P8139 | |
| DNAse1 | Roche | 11284932001 | |
| F12 DMEM | Wisent | 319-075-CL | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Integrid tissue culture dish with 20mm grid (150 x 25mm) | Falcon | 353025 |
References
- Saitoh, T., et al. Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1. Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).
- Bruns, S., et al. Production of extracellular traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin RodA. PLoS Pathog. 6 (4), e1000873 (2010).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Papayannopoulos, V., Zychlinsky, A. NETs: a new strategy for using old weapons. Trends Immunol. 30 (11), 513-521 (2009).
- McDonald, B., Urrutia, R., Yipp, B. G., Jenne, C. N., Kubes, P. Intravascular neutrophil extracellular traps capture bacteria from the bloodstream during sepsis. Cell Host Microbe. 12 (3), 324-333 (2012).
- Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. J Immunol. 185 (12), 7413-7425 (2010).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. J Immunol. 187 (1), 538-552 (2011).
- Khandpur, R., et al. NETs are a source of citrullinated autoantigens and stimulate inflammatory responses in rheumatoid arthritis. Sci Transl Med. 5 (178), 178ra140 (2013).
- Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13076-13081 (2012).
- Hahn, S., Giaglis, S., Hoesli, I., Hasler, P. Neutrophil NETs in reproduction: from infertility to preeclampsia and the possibility of fetal loss. Front Immunol. 3, 362 (2012).
- Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. J Clin Invest. , (2013).
- Cools-Lartigue, J., Spicer, J., Najmeh, S., Ferri, L. Neutrophil extracellular traps in cancer progression. Cell Mol Life Sci. , (2014).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. J Vis Exp. (36), (2010).
- Maqbool, M., Vidyadaran, S., George, E., Ramasamy, R. Optimisation of laboratory procedures for isolating human peripheral blood derived neutrophils. Med J Malaysia. 66 (4), 296-299 (2011).
- Boyum, A. Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Scand J Immunol. Suppl. 5, 9-15 (1976).
- Calado, R. T., et al. Sex hormones, acting on the TERT gene, increase telomerase activity in human primary hematopoietic cells. Blood. 114 (11), 2236-2243 (2009).
- Zhong, C., Qu, X., Tan, M., Meng, Y. G., Ferrara, N. Characterization and regulation of bv8 in human blood cells. Clin Cancer Res. 15 (8), 2675-2684 (2009).
- Wu, Y. J., et al. In vivo leukocyte labeling with intravenous ferumoxides/protamine sulfate complex and in vitro characterization for cellular magnetic resonance imaging. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (5), C1698-C1708 (2007).
- Saffarzadeh, M., et al. Neutrophil extracellular traps directly induce epithelial and endothelial cell death: a predominant role of histones. PLoS One. 7 (2), e32366 (2012).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
