This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.
Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-α subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-λ2 and -λ3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.
Type I og III interferoner (IFN) er kritiske i immunresponset til vira og andre patogene stimuli og til stede i alle hvirveldyr 1. Immune og ikke-immune celler udtrykker og udskiller, samt reagere på, IFN 2. Medfødte immunsystem sensorer, såsom toll-lignende receptorer (TLR), STING og RIG-I, inducere type I og III IFN ekspression ved detektion af patogen forbundet molekylære mønstre (Pamp) 3,4. Hos mennesker, type I IFN omfatter IFN-β, -ω, -κ og 12 undertyper af IFN-α og binder til IFNAR1 / IFNAR2 receptor-komplekset 2,5. Type III IFN omfatter IFN-λ1, -λ2 og -λ3 og binder til IL10RB / IL28RA receptorkomplekset 2. Klassisk, type I og III IFN binder til deres respektive receptorkomplekser som derefter rekrutterer STAT1 / STAT2 heterodimerer og initiere transskription af interferon stimulerede gener (ISG) 6. ISG er involveret i en bred vifte af funktioner, fra antiviral og antiproliferativ aktivitet til aktivering af svaret 7 adaptive immunrespons.
De mange mekanismer patogener har udviklet til at omgå, undergrave og kapre elementer i IFN signalering pathway vise betydningen af IFN i immunresponset medfødte 8. For eksempel vaccinia virus udtrykker en attrap receptor med IFNAR1 homologi der sekvestrerer type I IFN 9, mens en Yaba-lignende sygdom virus udskiller et glycoprotein, der inhiberer type I og III IFN-proteiner 10. Ud over deres rolle i værtsforsvar er IFN også impliceret i cancer overvågning og en række af auto-inflammatoriske sygdomme: silencing af IFN ekspression i brystcancerceller begrænser immunosurveillance 11 overproduktion af IFN-α er en mekanisme i udviklingen af systemisk lupus erythematosus 12 og vildfaren aktivering af STING fører til systemisk inflammation forårsaget af store mængder af IFN i STING-associeret vaskulopati13. Terapeutisk IFN anvendes til behandling af multipel sklerose 14, kroniske virusinfektioner såsom HBV 15 og HCV 16,17, og cancere, såsom hårcelleleukæmi 18 og kronisk myeloid leukæmi 19. Spørgsmål om relevansen af IFN i en bestemt fysiologisk proces kontinuerligt afslører den allestedsnærværende karakter af denne cytokin familie.
Type I IFN, især IFN-α-undertyper, der ofte betragtes som en enhed 20-23, snarere end som en gruppe af nært beslægtede, men forskellige, proteiner. Eksistensen og persistens af multiple IFN arter herunder IFN-α-undertyper hele hvirveldyr evolution 24 antyder, at i det mindste en delmængde af disse undertyper har specifikke eller unikke funktioner. Det er muligt, at der definerer mønstre af IFN ekspression vil dechifrere og hjælpe karakterisere de specifikke funktioner af en eller flere af de undertyper 17. Udfordringen i at studere than type I og III IFN subtyper er baseret på deres fælles sekvensidentitet: tolv IFN-α undertyper dele> 50% 25 og IFN-λ undertyper deler 81-96% 26 af deres aminosyresekvenser. I den beskrevne QRT-PCR assay molekylærbeacon (MB) og låst nukleinsyre (LNA) fluorescerende prober diskriminere enkelt forskelle basepar mellem de meget lignende IFN undertype sekvenser og tillade karakterisering af IFN ekspression signatur. Analysen er 384 brønde format indeholder både kvantitative (protokollatet standarder) og semi-kvantitative (housekeeping-gener (HKG)) foranstaltninger, der giver mulighed for analyse af udskrift nummer og ΔCq hhv. Batch samling, lettes ved automatiseret multikanals pipettering, og langtidsopbevaring, muligt ved tørring af primer / probe (Pr / Pb) fastsættes på pladerne, forbedre reproducerbarheden, nytteværdi, og praktiske analysen.
Denne protokol beskriver processentil fremstilling af 384-brønds QRT-PCR assay plader (figur 1) med op til sytten forskellige Pr / Pb sæt rettet humane IFN subtyper (tabel 1). Pr / Pb indstille arbejdslager source plader (figur 2) anvendes til at fremstille multiple 384-brønds assayplader i en proces, der kan automatiseres ved hjælp af en robot multikanalpipette. Mens oprindelige fokus var på at skabe en protokol til at studere human IFN udtryk underskrifter er denne metode blevet anvendt på makakaber så godt. Selvom plade layout er lidt anderledes og Pr / Pb sæt (tabel 2) er forskellige, den samlede forberedelse metode til at skabe de menneskelige og rhesus plader er identiske. Med minimale ændringer af protokollen, kunne den metode udføres for at give mulighed for udvikling af assays til at studere andre grupper af nært beslægtede gener.
Se figur 1 og 2 nedenfor
Se tabel 1 og 2 Below
Denne rapport beskriver design, serieproduktion, og en tilgang til analyse af et assay til måling af transskription af et sæt af meget lignende gener i et forskningslaboratorium indstilling. Den high-throughput QRT-PCR analyse rapporteres her måler IFN og – λ undertyper med høj specificitet. Denne metode indebærer to centrale aspekter, design af Pr / Pb-apparater, der diskriminerer mellem medlemmer af et homologt gen familie og udvikling af en produktionsplatform for oprettelse af pålidelige og sammenhængende 384-brønds assayplader præinstalleret med PR / PB sæt. De QRT-PCR-prober indarbejde en strukturel (MB) eller kemisk (LNA) tilgang til at øge deres specificitet 29. For to af primersæt i rhesus assay (tabel 2) blev amplifikationen-refraktære mutation (ARMS) inkorporeret i primersekvenserne for yderligere at forbedre specificiteten 30. Selv om det er generelt bedst til at målrette exon-exon junctions til enhance specificitet af en QRT-PCR-reaktion, var dette ikke muligt, fordi type I IFN generne mangler introns. Derfor vil genomisk DNA amplificeret i PCR-reaktionen, og skal nedbrydes ved DNase-behandling efter RNA-ekstraktion.
Målet region for PR / PB sæt var begrænset til de kodende regioner af det modne peptid for hver IFN. På grund af den høje sekvenslighed blandt IFN-α-undertyper, især den modne peptid region, var det undertiden nødvendigt at gå på kompromis følsomhed for at sikre specificitet. Dette var især tilfældet med IFN-α17, hvor det modne peptid transskript har kun fire unikke baser når sammenlignet med andre IFN-α-undertyper. Målretning IFN-α17 krævede primere, som binder de udskrifter af flere undertyper, der begrænser specificitet til sonden. Som følge heraf vil PCR-reaktionen amplificere andre undertyper end IFN-α17, hvorved der forbruges en væsentlig procentdel af PCR-reagenser og lowering amplituden af fluorescenssignalet fra den specifikke probe til IFN-α17. En yderligere udfordring i retning designe følsomme og specifikke Pr / Pb sæt til meget lignende gener, såsom IFN er den mulighed, at den kommenterede sekvenser i GenBank-databasen ikke kan være fuldstændig eller omfattende på tidspunktet for design. Igen var det en udfordring for IFN-α17, hvor nyligt kommenterede sekvenser ikke slutter perfekt med den version af sekvensen i databasen på tidspunktet for design. Derfor, når designe Pr / Pb sæt til gener, som ikke er intensivt undersøgt, er det klogt at regelmæssigt kontrollere den seneste kommenteret sekvens af et målgen. Endelig er det nødvendigt at sikre, at de Pr / Pb sæt ikke forstærke pseudogener som kan transskriberet men oversat ikke.
Efter at designe PR / PB sæt, er den næste udfordring at optimere PCR betingelser i sytten forskellige Pr / Pb sætter på en 384-brønds plade. Udskrift standarder er betydtigt i at teste specificiteten af en Pr / Pb sæt og bliver afgørende for harmonisering af qRT-PCR-betingelser for de mange forskellige PCR-reaktioner. Test en Pr / Pb sæt mod Transcript standarder fastlægger dens effektivitet og følsomhed; plasmider, der udtrykker meget lignende pseudogener kan være nødvendigt at sikre, at Pr / Pb indstillet selektivt måler transkription af funktionelt gen. Transcript standarder også en kvantitativ hjælp af analyse (antal transkripter) i tillæg til den semi-kvantitativ analyse i forhold til en husholdning gen (ΔCq).
Robotic multikanal pipettering fra en 96-brønds kilde plade i flere 384-brønds assayplader forbedrer præcision og konsistens af inter-plade resultater. Laks sperm DNA (ssDNA) anvendes som en bærer, der stabiliserer og bevarer Pr / Pb sæt til langtidsopbevaring, ligesom tørring af reagenser dispenseret i pladerne. Tørring pladerne formindsker også volumenet af reaktionennødvendige for reproducerbare resultater, hvilket igen bevarer værdifulde prøver og nedsætter brugen af dyre reagenser. Gennem disse trin, er partier af plader samles der giver præcision og konsistens i mere end seks måneder.
Efter forberedelse plade, kvalitetskontrol foranstaltninger er afgørende for at kontrollere sammenhængen i et parti af plader. Til dette formål er yderligere fire sæt af standarder køre på en tallerken. Den "5x standard" plade spor og skaber et datasæt, som en individuel plade standarder sammenlignes. Mens ti 10-fold fortyndinger af hver standard anvendes under assay design, pladshensyn kræver, at fire punkter anvendes til standardkurven på hver assayplade og for 5x standard plade. Derudover bør en positiv kontrol inkluderes på hver plade for at sikre gyldigheden af pladen.
Det tager typisk 3-4 timer til at forberede seks assayplader fra én Pr / Pb silde plade; det er muligt at fremstille tolv plader på en enkelt dag i et forskningslaboratorium. Da hver human IFN undertype assaypladen undersøger sytten Pr / Pb-apparater og kan rumme femten eksperimentelle prøver, en dag forsamlingsfrihed producerer en batch af plader med kapacitet til at generere op til 3.060 eksperimentelle datapunkter. Rådata fra QRT-PCR-platform, kan behandles og samles ved hjælp af programmering scripts i et regneark software til automatisk at udfylde en forhåndsudformede analyse skabelon. Denne metode minimerer hands-on indtastning af data, hvilket forhindrer kopiering fejl og tillader investigator til at fokusere på dataanalyse i stedet data forsamling. Som beskrevet her, kan denne high-throughput QRT-PCR assay anvendes til at måle ekspressionen af interferon-undertyper i humane eller rhesus macaque prøver og kan tilpasses til brug for andre arter eller homologt gen sæt. Fleksibiliteten af pladen layout tillader brugeren at ændre primer / probe indstiller at skræddersy generinteresse mod en bestemt celletype eller model system. Dette assay kan anvendes til at måle IFN ekspressionsvektorer signaturer i cellekulturmodeller studerer patogener eller i patientprøver i forbindelse med sygdomsmodeller at belyse signaleringsdata mekanismer involveret i immunrespons.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af CBER / FDA-NIAID / NIH Interagency aftalen Yi AI-6153-01, FDA / CBER murene midler, og FDA medicinske modforanstaltninger Initiative. TCT, MNB, VPM, LMS, og KDK blev støttet af en udnævnelse til forskning Deltagelse Program ved Center for Biologics Evaluation og Forskning administreres af Oak Ridge Institute for Science Education gennem en Interagency aftale mellem USA Departmen of Energy og USA Food and Drug Administration.
0.2mL PCR Tube Strips | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | E0030 124 286 | |
12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 0.5-12.5uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-139 | *Discontinued |
12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 1-30uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-137 | *Discontinued |
12-channel Electronic Pipette, 5-250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-118 | *Discontinued |
2.0mL Micro Centrifuge tube, sterile | Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA) | 229446 | |
8-channel Electronic Pipette, 15-1250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-115 | *Discontinued |
Disposable Reagent Reservoirs | VWR International (Radnor, PA, USA) | 89094-668 | 25mL reservoirs with 2 dividers |
E-Centrifuge | Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA) | 1090003 | |
Eukaryotic 18S rRNA (18S) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs99999901_s1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
Fixed Speed Mini Vortexer | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 02-215-360 | |
Gas Permeable Adhesive Plate Seal | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB-0580 | Disposable plate seal used during the plate preparation process |
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | Human HKG Primer/probe set |
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Rh02621745_g1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
Hudson Solo automated multichannel pipettor | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800200 | Modified with a 384-well cooling nest |
Linearized plasmids (IFN genes) | Aldevron (Fargo, ND, USA) | Custom Order | Item 3000, 3580; used for assay standards |
LNA inhibitors | Exiqon (Woburn, MA, USA) | Custom Order | Item 500100 |
LNA Probes | Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA) | Custom Order | Material number VC00023 |
Matrix Filtered Pipet Tips, 12.5uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-193 | |
Matrix Filtered Pipet Tips, 30uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-196 | |
Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-160 | |
Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-152 | |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4309849 | |
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | N8010560 | |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4311971 | Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run |
Microsoft Excel 2010 Spreadsheet | Microsoft (Redmond, WA, USA) | Office 2010 | Visual Basic programming language |
MixMate Vortex Mixer | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | 5353 000.014 | 2 dimensional plate vortex apparatus |
Molecular Beacon Probes | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | Z606634-1EA | |
Plate Dryer (manifold) | Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA) | Custom Order | |
Primer sets | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
pUC57 plasmid DNA | Genescript (Piscataway, NJ, USA) | SD1176 | |
Rnase-Free 1.5mL Microfuge Tubes | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | AM12400 | |
RNase-free DNase Set (50) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 79254 | |
RNase H | New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA) | M0297L | |
RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 74106 | |
Robot Tips (clear tip pre-sterilized pipet tips) | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800350-S | |
Salmon Sperm DNA Solution | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 15632-011 | |
SoftLinx Version V | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | Custom Order | Software for programming pipetting steps |
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), no AmpErase UNG | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | 4352042 | |
ABgene Adhesive Plate Seals | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB0580 | |
Ubiquitin C (UBC) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs01871556_s1 | Human HKG Primer/probe set |
Verso cDNA synthesis Kit | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB1453B | |
ViiA 7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4453536 | |
Water-Ultra Pure | Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA) | 351-029-101 | |
Zipvap 384 (plate dryer heating element) | Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA) | 384-109A | Plate Dryer |