EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in water per cultuur en RT-qPCR. Deel III. Virus Detectie door RT-qPCR

Opmerking: Gebruik datasheets om alle stappen van het protocol te volgen; bijvoorbeeld informatiebladen worden gegeven in de aanvullende materialen Tables S2-S4. 1. Standard Curve Voorbereiding Bereid een werkvoorraad van de standaardcurve reagens (bijv gepantserde RNA EPA-1615) door verdunnen van de door de fabrikant aan een concentratie van 2,5 x 10 8 deeltjes / ml (2,5 x 10 8 GC / ml) met behulp TSM concentratie III buffer. Verdeel de werkvoorraad in 250 ul fracties met 1,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C. OPMERKING: Zie aanvullende materialen protocol Stap S1 voor instructies over het voorbereiden van werkvoorraden van virus en plasmiden voor het gebruik als alternatieve standaard curve reagentia. Ontdooien van één of meer van de werkvoorraad porties. Bereid vijf 10-voudige seriële verdunningen gebruikt 1,5 ml microcentrifuge buizen, waardoor concentraties van 2,5 x 10 7, 2,5 x 10 6, 2,5 x10 5, 2,5 x 10 4 en 2,5 x 10 3 GC / ml. Maak de eerste verdunning door toevoeging van 25 ul van de 2,5 x 10 8 GC / ml werkvoorraad tot 225 ul van TSM III buffer. Mix voor 5-15 sec met behulp van een vortex mixer. Bereid de volgende verdunning door toevoeging van 25 ul van de bereide in stap 1.2.1 tot 225 gl TSM III buffer verdunnen. Meng opnieuw en verder een soortgelijk proces om de volgende drie 10-voudige verdunningen te bereiden. Pak het RNA uit de standaard curve werkvoorraad en de vijf verdunningen onmiddellijk volgens de procedure in paragraaf 3. 2. Tertiaire Concentratie Bereid een centrifugale concentrator (30.000 moleculair gewicht cut-off) voor elk door toevoegen van ten minste 10 ml 1 x PBS, 0,2% runderserumalbumine (BSA) aan de bovenste monsterkamer verzamelde monster. Zorg ervoor dat oplossing heeft de dunne kanaal concentratie kamer gevuld, en houd dan O / N bij 4 ° C. <li> Gooi het fluïdum. Spoel de concentrator één keer met ten minste 10 ml steriel reagens kwaliteit water om overtollig BSA te verwijderen en vervolgens het water te verwijderen. Voeg een hoeveelheid secundaire water concentraat uit elk monster gelijk is aan S, de Assay Sample Volume in afzonderlijke centrifugale concentrators. Bereken S met behulp van Vergelijking 1, Waarbij D de jaargang van Original Water monster geanalyseerd, TSV is de totale steekproef Volume en FCSV is de Final Geconcentreerde Sample Volume. Zie aanvullend materiaal S2 voor een voorbeeld van de berekening van S. Centrifuge Elk monster bij 3.000-6.000 xg bij 4 ° C in een swinging bucket rotor gedurende 20 – 30 min. Controleer het volume in de dunne kanaal concentratie kamer. Indien het volume groter is dan 400 pl, opnieuw centrifugeer gedurende 20 minuten of langer. Doorgaan centrifugeren totdat het monster in the dunne kanaal concentratiekamer is teruggebracht tot minder dan 400 pl. Gebruik de bovenstaande niet verwijderen. Was de zijkanten van de centrifugale concentrator met 1 ml steriele 0,15 M natriumfosfaat, pH 7-7,5 virus, te verhogen. Centrifugeer opnieuw bij 3.000-6.000 xg en 4 ° C totdat het monster is teruggebracht tot minder dan 400 pl. Herhaal deze wasstap een extra tijd. Met een 100-200 pi micropipet nauwkeurig meten en breng elke geconcentreerd monster op een 1,5 ml microcentrifugebuis (dwz overdracht 200 ul aan de microcentrifugebuis en meet de resterende concentraat door aanpassing van de micropipet totdat de resterende vloeistof volledig kan worden opgemaakt in de pipet tip). Voeg 0,15 M natriumfosfaat, pH 7-7,5, om het uiteindelijke volume op 400 ± 2 ul passen. Extract nucleïnezuur direct door te gaan naar stap 3. Houd elke geconcentreerde monsters die niet kunnen worden processed onmiddellijk bij 4 ° C voor niet meer dan 24 uur. 3. Nucleïnezuurisolatie Voeg 200 gl extractiebuffer bereid zoals beschreven in stap 3,3 en 200 ul van de tertiaire concentraat uit elk monster van stap 2,5 of standaardcurve verdunning van Stap 1,3 tot scheiden gelabelde 1,5 ml microcentrifuge buisjes. Freeze overgebleven tertiaire concentraten bij of beneden -70 ° C. Extraheer de nucleïnezuren uit elk monster zoals door de nucleïnezuurextractie fabrikant kit voor de rotatie protocol voor bloedmonsters met de volgende uitzonderingen. Heeft protease niet toe te voegen aan de watermonsters of gebruik het met het nucleïnezuur extractie kit geleverd extractiebuffer. Bereid extractiebuffer met carrier RNA Voeg 310 ul van carrier RNA verdunningsbuffer een flesje dat 310 ug carrier RNA. Mengen op te lossen en vervolgens verdelen in 6 porties met ongeveer 50 pl. Bewaren bij -20° C. Voeg 28 ul van ontdooide carrier RNA per ml van de extractiebuffer een carrier RNA-concentratie van 0,027 pg / pl te verkrijgen. Gebruik de drager-RNA gewijzigd extractiebuffer in de plaats van die met de winning kit geleverd. Bereid een stamoplossing elutiebuffer door het toevoegen ribonuclease (RNase) Inhibitor tot een uiteindelijke concentratie van 400 eenheden / ml aan de met de extractie kit elutiebuffer. Elueer RNA van het nucleïnezuur bindende spinkolom door het plaatsen van 50 ui elutiebuffer met RNase inhibitor in de kolom. Wacht 1 minuut en centrifugeer bij 6000 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur. Herhaal stap 3.4.1 en vervolgens te verwijderen en gooi de kolom. Bereid hoeveelheden van de RNA-extracten uit stap 3.4.2. Bereid 6 monsters van de standaard curve werkvoorraad en elke standaard curve verdunning die ten minste 15 ul elk. Bereid 4 aliquots van alle RNA-monsters met ten minste22 pl elk. Sla een aliquot van elk monster en de standaard curve controles bij 4 ° C of ze kunnen worden verwerkt door reverse transcriptie binnen 4 uur; Anders manier alle monsters bij of beneden -70 ° C. 4. Reverse transcriptie (RT) Bereid 100 uM voorraadoplossing van elke oligonucleotide primer en probe in tabel 1 opgesomd door toevoeging van een volume van PCR-grade water aan elk flesje via een hoeveelheid (in microliter) gelijk aan tien keer het aantal nanomolen (nmol) van het oligonucleotide in de flesje (zoals aangegeven op de flacon etiket of in de productbeschrijving van de fabrikant (bv, resuspendeer een primer met 36,3 nmol in 363 pi). Meng op te lossen. Verdun de 100 uM oplossingen 1:10 met PCR-kwaliteit water tot 10 uM werkende oplossingen voor te bereiden. Bereid RT Master Mix 1 en 2 in een schone kamer met behulp van de gids in tabel 2. Pipetteer 16,5 ul van RT Master Mix 1 voor elke PCR-plaat en met behulp van een multichannel pipet. Dooi, als bevroren, de nucleïnezuur fragmenten van elk veld monster en Lab Versterkte Sample Matrix (LFSM, dat wil zeggen, gezaaid water matrix monster). Verdun elk veld en LFSM sample 1: 5 en 1:25 in elutiebuffer die 400 eenheden / ml RNase inhibitor. Dooi, als bevroren, maar niet verdunnen Lab Versterkte Blank (LFB, dat wil zeggen, een positieve kwaliteitscontrole met zaadjes reagenskwaliteit water), Lab blanco (LRB, dwz een negatieve kwaliteitscontrole met behulp van reagenskwaliteit water), Performance Evaluation (PE , dat wil zeggen, gezaaid reagenskwaliteit watermonsters gebruikt om laboratorium prestaties voorafgaand aan de start van een studie), de Test van prestaties (PT evalueren; dat wil zeggen, gezaaid reagenskwaliteit watermonsters met titers onbekende een analist die worden gebruikt om de laboratoria te evalueren tijdens een studie ), NA Batch negatieve extractie controle, of gewonnen RNA uit de standaard curve set. </ol> Plaats 6,7 ul van het RNA uit elk monster, controle en standaard curve in afzonderlijke PCR putjes, met drievoudige putjes voor monsters en controles en dubbele putten voor standaard curves (zie figuur S1 voor een RT plaat voorbeeld). Plaats 6,7 ul van elutiebuffer in afzonderlijke PCR putjes voor geen template controle (NTC). Omvatten 2-8 NTC per RT plaat, met behulp van twee voor het eerste monster en vervolgens twee meer voor elke vierde extra monster. Verdeel de negatieve extractie en NTC controles in de hele plaat. Verzegeling van de PCR-plaat met een hittebestendige plaat sealer. Meng de monsters voor 5-10 seconden en centrifugeer bij ≥ 500 xg kort. Incubeer de plaat gedurende 4 min bij 99 ° C en koel daarna snel tot 4 ° C in een thermische cycler. Weer centrifuge bij ≥ 500 xg kort. Verwijder voorzichtig de plaat afdichting en voeg dan 16,8 ul van RT Master Mix 2 aan elk putje. Seal de plaat opnieuw met een hittebestendige plaat sealer, gevolgd door mengen en kort centrifugeren bij ≥ 500 x g. Plaats de plaat in een thermocycler en looptijd van 15 minuten bij 25 ° C, gevolgd door 60 min bij 42 ° C, 5 min bij 99 ° C, en vervolgens door een 4 ° C hold cyclus. Werkwijze onmiddellijk of binnen 8 uur door qPCR (stap 5) en bewaar monsters bij of beneden -70 ° C totdat ze kunnen worden verwerkt. WINKEL monsters die kunnen worden verwerkt binnen 8 uur bij 4 ° C. 5. real-time kwantitatieve PCR (qPCR) Bepaal de gemiddelde hepatitis G Cq waarde voor elke partij van hepatitis G reagens voorafgaand aan het uitvoeren van elke proefmonsters. Uitvoeren van een RT-bepaling via 10 duplo bereid zoals beschreven voor NTC controles (stap 4.1.1). Voer het hepatitis G qPCR assay zoals hieronder beschreven (Stappen 5.2 tot 5.5.3). Bereken de gemiddelde waarde van de Cq 10 duplo's. Pas het hepatitis G reagens hoeveelheid RT Master Mix 1 (tabel 2), Indien nodig, tot een gemiddelde Cq waarde tussen 25 en 32 eenheden ontvangen. Compenseren verhoogd of verlaagd door het volume van het water veranderen hoeveelheid toegevoegd aan de RT Master Mix 1 uiteindelijke volume op 16,5 ul per test te houden. Bevestig eventuele aanpassingen door te herhalen stappen 5.1.1 tot 5.1.2 en verandering tabel 2 van de aangepaste hoeveelheden weerspiegelen. Voorbereiden qPCR mastermengsels in een schone kamer met behulp van de geleiders in Tabel 3 voor enterovirus, Tabel 4 en Tabel 5 voor norovirus genogroup I, tabel 6 voor norovirus genogroup II, tabel 7 voor muizen norovirus (norovirus genogroup V), en Tabel 8 voor hepatitis G. Mix elke master mix en centrifugeer bij ≥ 500 xg kort. Voeg de PCR mastermengsels aan de juiste putjes van een label optische reactie plaat, met behulp van 14 pi per putje en afzonderlijke platen voor elke qPCR assay (zie Figuur S2 </stronG> een mogelijke lay-out voor een qPCR assay gebaseerd op het RT layout in figuur S1). Ontdooi de RT plaat van stap 4.8 bij RT, als bevroren. Meng met behulp van een plaat mixer en centrifugeer bij ≥ 500 xg kort. Verdeel 6 pl van de geschikte cDNA aan de juiste putjes van de optische reactieplaat. Meng de monsters in de optische reactie plaat en centrifugeer bij ≥ 500 xg kort. Voer het hepatitis G qPCR test op het onverdunde en verdunde veld en LFSM monsters voordat u alle andere qPCR assays. Gebruik de laagste verdunning van het veld of LFSM steekproef die is <1 Cq waarde groter dan de gemiddelde hepatitis G Cq waarde voor het enterovirus en norovirus qPCR assays. Stel de kwantitatieve PCR thermocycler software volgens de instructies van de fabrikant. Identificeren van de standaard curve monsters als normen en voor elk standaard curve verdunning, voert de genomische kopie waarden aangegeven in tabel 9. <li> Voer de plaat in de kwantitatieve PCR thermal cycler gedurende 10 min bij 95 ° C, gevolgd door 45 cycli van 15 sec bij 95 ° C en 1 minuut bij 60 ° C. Bepalen of elke standaard curve aan de acceptabele waarden in tabel 10. Zie aanvullende materialen sectie S3 voor voorbeelden. Bereken de totale standaarddeviatie (StdDev) voor de standaard curve met behulp van Vergelijking 2, waarbij Cq is de waarde gerapporteerd voor elke standaardcurve repliceren, Cq is de gemiddelde waarde voor elke set van herhalingen, #Cq is het totale aantal Cq waarden voor alle standaard controle herhalingen die positieve waarden (dat wil zeggen, niet onbepaald) hebben, en # Stds is het aantal standaard controles die positieve waarden hebben. Als de kwantitatieve PCR thermische cycler software niet berekenen de helling voor elke standaard curve, het berekenen van de helling met behulp van Vergelijking 3,60; waarbij Cq is het gemiddelde van de hoogste en laagste gebruikte verdunningen en log GC is de log van de genomische kopie waarde van de hoogste en laagste verdunningen gebruikt in tabel 9. Bereken de R2 waarde met Vergelijking 4. waarbij Cq is het gemiddelde van alle waarden en Cq Log GC de gemiddelde Log GC voor elke herhaling. Bereken het% Efficiency met Vergelijking 5: Noteer de GC-waarden berekend door de thermische cycler software voor alle monsters op basis van standaard curven die aan de in tabel 10 criteria en de gemiddelde GC waarden voor elk monster. Herhaald elke monsters met standaard bochten die niet voldoen aan de criteria van <strong> Tabel 10 of wanneer een negatieve controles (LRB, NA Batch negatieve extractie controle, of NTC) zijn positief. Opnieuw verwerken elke monsters die niet aan de criteria voldoen of vals positieve controles tijdens de herhaling. Bepaal de GC per liter (GC L) voor elk monster met behulp van Vergelijking 6: waarbij GC is het gemiddelde genomische kopij van stap 5,7, de factor "199" is de totale verdunningsfactor voor volumereducties die tijdens de tertiaire concentratie RNA-extractie en RT-qPCR stappen DF = verdunningsfactor die compenseert voor remming en D is het volume van Original Water Sample getest in liters. Zie supplementaire materialen sectie S4 voor een voorbeeld van de berekening van GC L. Bereken de totale GC van LFB en LRB monsters door GC gemiddelde waarde uit stap 5.5 vermenigvuldigen met 199 en te delen door 0,3.