Простой и недорогой метод для определения холодную чувствительность и адаптация в мышах
Summary
The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 °C and 5 °C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.
Abstract
Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 °C to 5 °C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.
Introduction
Измерение холодной реагирования на грызунах важно для улучшения понимания потенциальных механизмов холодного чувствительности у человека в нормальных и патологических условиях. Холодная подошвенный анализа (CPA), изначально разработанная несколько лет назад 1, предназначен для генерации воспроизводимые и однозначные мышиные поведенческих реакций на холодную стимул поставки при комнатной температуре. Более поздние усовершенствования этого анализа позволили воспроизводимое измерение холодной чувствительности в широком диапазоне температур 2. Обе версии также разработан, чтобы быть относительно высокую пропускную способность и недорогой в использовании.
Значительный прогресс был достигнут в понимании механизмов холодной чувствительности с использованием других поведенческих методов. Один метод испытания испарения ацетона, который включает в себя вытирать или распылением ацетона на лапы мыши и измерения количества времени, которое тратит мыши щелкая лапу 3,4. К сожалению,ответы на испарения ацетона посрамлены мокрым ощущения и запах ацетона. Кроме того, холодный стимул, который применяется в тесте испарения ацетона может изменяться в зависимости от количества ацетона прикладной, и трудно определить количественно. Наконец, неповрежденной мыши имеют минимальные ответов на ацетона в основании, что делает невозможным измерить обезболивание при отсутствии чувствительности с помощью этого метода.
Другой классический тест для холодных ответов есть хвост щелчок анализа, где задержки к выходу измеряется после того, как хвост погружали в холодную воду 5,6. В то время как поведенческие реакции в этом тесте являются однозначными и анализ измеряет ответов на определенной температуре, животные должен удерживаться во время тестирования, которое может изменять холодной отклика с помощью хорошо описанных индуцированных стрессом обезболивающих механизмов 7.
Другой часто используемый инструмент является тест холодная плита, которая измеряет поведенческиеОтветы мышей после их помещают на тарелку Пельтье охлаждением 8-10. В то время как этот инструмент предоставляет информацию о реакции животных на конкретных температурах, было также противоречиво используются; различные группы измерили различные типы реакций, включая числа скачков 8,11, задержки в первой реакции 8,11- 13, а количество лапы поднимает 11,13,14 с очень разными результатами. Холодная плита анализ также относительно низкая пропускная способность, как только у одного животного могут быть проверены одновременно, и это требует дорогих и хрупких Пельтье устройство.
Тест предпочтения Температура 2-пластина обычно используется производное теста холодной пластины, который измеряет относительное количество времени, которое животные проводят на 2 соединенных пластин различных температурах 9,15- 17. Другой подобный тест широко используется в термический градиент анализа, где количество времени, которое мышей проводят в различных температурных зонв диапазоне от 5 ° С до 45 ° С на длительный металлической пластины измеряется 16. Хотя эти анализы позволяют сравнивать температуры, неясно, является ли поведение температуры отвращение или предпочтениями температуры.
Наконец, динамический холодной пластины анализа была использована, чтобы оценить, насколько мышей реагировать на изменение температуры окружающей среды 18. Этот метод включает в себя размещение мышей на Пельтье устройства RT и наращивает его до 1 ° С при измерении, сколько мышей прыгать или лизать лапы при различных температурах пластины. Хотя это тесты, как мыши, адаптироваться к охлаждающей среде, не обеспечивают способ, чтобы проверить, насколько мышей реагируют на холодную стимула в установлении более низкой температуре окружающей среды. Кроме того, он требует дорогостоящего оборудования для выполнения и не дает возможность акклиматизироваться мышей испытательного оборудования перед измерением их холодной чувствительность.
В дополнение к этим анализы, CPA проверяет ACCLIMAответы Тед четко определенной холодной стимула в различных температурных интервалах, или в процессе адаптации к низким температурам окружающей среды. Она может испытать до 14 мышей в то время, с нашей нынешней аппарата, с потенциалом, чтобы быть недорого расширены для высокой пропускной испытаний.
Protocol
Representative Results
Discussion
The CPA can be used to assess cold sensitivity and cold adaptation in mice. It provides an affordable, efficient way to measure cold responses in unrestrained, acclimated animals at a wide variety of temperature ranges. It also provides an unambiguous behavioral response with an easily quantified and analyzed output variable. It has already been used to assess changes in cold sensitivity induced by inflammation1, neuropathic injury1, analgesics1, genetic knockouts20, and ge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge contributions from the entire Gereau Lab for manuscript editing. This work is supported by NINDS funds 1F31NS078852 to DSB and NINDS fund NS42595 to RWG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T-type thermocouple probe | Physitemp | IT-24p | Used to measure the surface temperature of the glass (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/) |
| Glass plate | Local glass company (in St. Louis, Stemmerich Inc) | N/A | We use pyrex glass (borosilicate float). Our lab generally uses 1/4'', but 3/16'' and 1/8'' are also useful |
| Thermal Data logger | Extech | EA15 | Thermologger to keep track of glass temperature (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408) |
| 3mL Syringe | BD | 309657 | The top is cut off, and dry ice is compressed in the syringe to generate a cold probe |
| Computer | If using Extech logger, any Pcwill work | N/A | |
| Aluminum boxes | Washington University in St. Louis machine shop | N/A | boxes are 3' long, 4.5'' wide, and 3'' tall with a sealed lid. There is a 1/2'' hole drilled into one short side of each box, near the bottom. These holes are filled with rubber stopcocks when the boxes are filled with wet ice or hot water. |
| Heated water circulator | VWR | Any water circulator model with a pump will work | |
| 21 gauge needle | BD | 305165 | The exact needle size is not important |
| Hand timer | N/A | Any hand timer will work | |
| Mirror | N/A | Any flat mirror will work |
References
- Brenner, D. S., Golden, J. P., Gereau, R. W. A Novel Behavioral Assay for Measuring Cold Sensation in Mice. Plos ONE. 7 (6), 8 (2012).
- Brenner, D. S., Vogt, S. K., Gereau, R. W. A technique to measure cold adaptation in freely behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. , (2014).
- Choi, Y., Yoon, T. W., Na, H. S., Kim, S. H., Chung, J. M. Behavioral signs of ongoing pain and cold allodynia in a rat model of neuropathic pain. Pain. 59 (3), 369-376 (1994).
- Gauchan, P., Andoh, T., Kato, A., Kuraishi, Y. Involvement of increased expression of transient receptor potential melastatin 8 in oxaliplatin-induced cold allodynia in mice. Neuroscience letters. 458 (2), 93-95 (2009).
- Carlton, S. M., Lekan, H. A., Kim, S. H., Chung, J. M. Behavioral manifestations of an experimental model for peripheral neuropathy produced by spinal nerve ligation in the primate. Pain. 56 (2), 155-166 (1994).
- Pizziketti, R. J., Pressman, N. S., Geller, E. B., Cowan, A., Adler, M. W. Rat cold water tail-flick: A novel analgesic test that distinguishes opioid agonists from mixed agonist-antagonists. European Journal of Pharmacology. 119 (1-2), 23-29 (1985).
- Pinto-Ribeiro, F., Almeida, A., Pego, J. M., Cerqueira, J., Sousa, N. Chronic unpredictable stress inhibits nociception in male rats. Neuroscience letters. 359 (1-2), 73-76 (2004).
- Karashima, Y., et al. TRPA1 acts as a cold sensor in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (4), 1273-1278 (2009).
- Knowlton, W. M., Bifolck-Fisher, A., Bautista, D. M., McKemy, D. D. TRPM8, but not TRPA1, is required for neural and behavioral responses to acute noxious cold temperatures and cold-mimetics in vivo. Pain. 150 (2), 340-350 (2010).
- Allchorne, A. J., Broom, D. C., Woolf, C. J. Detection of cold pain, cold allodynia and cold hyperalgesia in freely behaving rats. Molecular pain. 1, 36 (2005).
- Colburn, R. W., et al. Attenuated cold sensitivity in TRPM8 null mice. Neuron. 54 (3), 379-386 (2007).
- Dhaka, A., Murray, A. N., Mathur, J., Earley, T. J., Petrus, M. J., Patapoutian, A. TRPM8 is required for cold sensation in mice. Neuron. 54 (3), 371-378 (2007).
- Bautista, D. M., et al. The menthol receptor TRPM8 is the principal detector of environmental cold. Nature. 448 (7150), 204-208 (2007).
- Obata, K., et al. TrpA1 induced in sensory neurons contributes to cold hyperalgesia after inflammation and nerve injury. The Journal of Clinical Investigation. 115 (9), 2393-2401 (2005).
- Tang, Z., et al. Pirt functions as an endogenous regulator of TRPM8. Nature communications. 4, 2179 (2013).
- Lee, H., Iida, T., Mizuno, A., Suzuki, M., Caterina, M. J. Altered thermal selection behavior in mice lacking transient receptor potential vanilloid 4. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25 (5), 1304-1310 (2005).
- Pogorzala, L. A., Mishra, S. K., Hoon, M. A. The cellular code for Mammalian thermosensation. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (13), 5533-5541 (2013).
- Yalcin, I., Charlet, A., Freund-Mercier, M. -. J., Barrot, M., Poisbeau, P. Differentiating thermal allodynia and hyperalgesia using dynamic hot and cold plate in rodents. The journal of pain official journal of the American Pain Society. 10 (7), 767-773 (2009).
- Callahan, B. L., Gil, A. S., Levesque, A., Mogil, J. S. Modulation of mechanical and thermal nociceptive sensitivity in the laboratory mouse by behavioral state. The journal of pain: official journal of the American Pain Society. 9 (2), 174-184 (2008).
- Brenner, D. S., Golden, J. P., Vogt, S. K., Dhaka, A., Story, G. M., Gereau, R. W. A dynamic set point for thermal adaptation requires phospholipase C-mediated regulation of TRPM8 in vivo. Pain. , (2014).
- Patwardhan, A. M., Scotland, P. E., Akopian, A. N., Hargreaves, K. M. Activation of TRPV1 in the spinal cord by oxidized linoleic acid metabolites contributes to inflammatory hyperalgesia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18820-18824 (2009).
- Fujita, F., Uchida, K., Takaishi, M., Sokabe, T., Tominaga, M. Ambient Temperature Affects the Temperature Threshold for TRPM8 Activation through Interaction of Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate. Journal of Neuroscience. 33 (14), 6154-6159 (2013).
- Rohacs, T., Lopes, C. M., Michailidis, I., Logothetis, D. E. PI(4,5)P2 regulates the activation and desensitization of TRPM8 channels through the TRP domain. Nature neuroscience. 8 (5), 626-634 (2005).
- Daniels, R. L., Takashima, Y., McKemy, D. D. Activity of the neuronal cold sensor TRPM8 is regulated by phospholipase C via the phospholipid phosphoinositol 4,5-bisphosphate. The Journal of biological chemistry. 284 (3), 1570-1582 (2009).
- Zhang, H., et al. Neurokinin-1 receptor enhances TRPV1 activity in primary sensory neurons via PKCepsilon: a novel pathway for heat hyperalgesia. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (44), 12067-12077 (2007).
- Wang, H., Zylka, M. J. Mrgprd-expressing polymodal nociceptive neurons innervate most known classes of substantia gelatinosa neurons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (42), 13202-13209 (2009).
