פסיפס דג הזברה Transgenesis לניתוח הגנום פונקציונלי של גנים שיתופיים מועמד בפתוגנזה גידול

סרטן הם מחלות מתקדמות המסומנות על ידי ההצטברות של מוטציות פתולוגיים, מחיקות ורווחי כרומוזום לאורך זמן. מומים גנטיים אלה יכולים להשפיע על תהליכים תאיים רבים, החל ממחזור התא, המוות של תאים, חילוף החומרים וההרכבה האנרגטיים של שלד התא להדגיש תגובות כגון היפוקסיה. לפיכך, יצירת גידולים משקפים את הפעולות הקולקטיביות של סטיות גנטיות מרובות על פני ספקטרום של תהליכים ביולוגיים. מאמצים האחרונים אינטגרטיבית הגנומי מחקר, כוללים רצף הגנום כולו, רצף exome, רצף ממוקד, רצף עמוק ומחקרי עמותת הגנום, זיהו מספר גדל והולך של שינויים גנטיים רומן במהותו את כל סוגי הגידולים ^1-4. במקרים רבים, הנגעים הגנטיים מתרחשים ביחד באופן לא-אקראי ^5-8, המצביעים על שיתוף הפעולה שלהם בפתוגנזה של מחלה. לנתח את התפקידים שבעור של המגוון הרחב של גנים הביעו aberrantly כתוצאה fROM נגעים הגנומי אלה יש צורך לתכנן אסטרטגיות טיפוליות חדשות ולהבין את התגובות של תאים סרטניים לסוכנים אלה, אבל זה הוכיח את עצמו להיות משימה מרתיעה, הדורש מערכות מודל חיה מאוד חזקות להתנהלות של אנליזה גנומית פונקציונלית תפוקה גבוהה ב vivo.

למרות יונקים, במיוחד מכרסמים, דגמים מועדפים בביולוגיה של סרטן, דג הזברה החלה למשוך תשומת לב רבה. דג הזברה החוליות (דריו rerio) נעשה שימוש כאורגניזם מודל למחקר פיתוח מאז 1960 ויושמה לראשונה לחקר פתוגנזה גידול בשינה 1982 ^9-11. קלות תחזוקה, גודל גוף קטן, ופוריות גבוהה להפוך את דג הזברה מודל חזק למסכים גנטיים קדימה בקנה מידה גדולה כדי לזהות מוטציות המעניקות פנוטיפים חריגים ופתולוגיים ^10. השקיפות האופטית של עוברי דג הזברה היא תכונת מפתח נוספת התומכות בשימוש רחב יותר של מודל סרטן זה, כהיא מאפשרת בתחום ההדמיה vivo להתנהל כדי לאתר התפתחות גידולים בזמן אמת ^9, יישום שהוא קשה יחסית במכרסמים ^12. ניתוח גנומיקה השוואתית האחרון של הגנום התייחסות דג הזברה (Zv9) חשף 26206 גני המקודדים חלבונים, עם 71% שיש orthologues אדם, מתוכם 82% מתואמים עם גנים הקשורים למחלות בירושת מנדל באינטרנט בMan (OMIM) מסד הנתונים ^{13, 14.} לוקמיה T-cell החריף לימפובלסטית (T-ALL) ^15,16, מלנומה ^17,18,, קרצינומה של לבלב כתוצאה מכך, דג הזברה כבר משמשת מודל סוגים שונים של סרטן, כגון: נוירובלסטומה ^8, סרקומה ע"ש יואינג ^{19, 20,21} ראדומיוסרקומה ^22, קרצינומה hepatocellular ²³ ומיאלואידית ממאירות ^24,25, ונבחרו כמודל לסרטן השתלה שלא מבן-מינית חוקר ^11,26.

מהונדס יציבגישה בדג הזברה משמשת בדרך כלל כדי לחקור את ההשפעה של רווח של פונקציה של גנים בהתפתחות נורמלית או היווצרות המחלה ^27,28. לפתח מודל (איור 1 א) כאמור, אחד מזריק מבנה ה- DNA המכיל את הגן של עניין מונע על ידי אמרגן רקמות ספציפיות לעוברי פרא-סוג אחד תאים. שלושה עד ארבעה חודשים לאחר ההזרקה, כאשר עובר המוזרקים מגיע לבגרות מינית, הם outcrossed עם דגי wild-type למסך לאלה המראים שילוב של DNA לבנות בתאי המין שלהם, שרישיונותיהם כדגי מייסד. גורמים רבים, כגון מספר העותק ואתר אינטגרציה של transgene, משפיעים על ביטוי של transgene בקווים מהונדסים יציבים. לכן, כדי לפתח מודל גידול מהונדס, קווים מהונדסים יציבים מרובים ביתר אונקוגן יחיד צריכים להיות שנוצרו ראשון והוקרנו לקו מבטא את הגן ברמה שעלולה להוביל לגידול אינדוקציה. עם זאת, אם ביטוי יתר של o מועמדncogene הוא רעיל לתאי נבט, קשה ליצור קו מהונדס יציב על ידי ישירות ביתר transgene ^29. לפיכך, גישה זו יכולה להיות זמן רב, עם סיכון גבוה לכישלון כדי ליצור מודל סרטן מתאים.

כאן, אנו ממחישים אסטרטגיה חלופית המבוססת על transgenesis החולף הפסיפס (איור 1) המספקת יתרונות ייחודיים על פני transgenesis היציב המסורתי למחקר גנומי פונקציונלי in vivo. בגישה זו, בונה transgene אחד או יותר הם שהוחדרו לתוך השלב אחד התא של עוברים מהונדסים או wild-type. בונה DNA המוזרקת מכילה transgenes אז הם משולבים mosaically ואקראי לדגים המוזרקים העיקריים, וכתוצאה מכך מעורבים גנוטיפים בתוך אוכלוסיות תאים מרובות בדגים בודדים ^30. יתר על כן, coinjection של DNA מרובה בונה בעוברי תא אחד מוביל לשיתוף השתלבות באותו התא באתרים אקראיים, המאפשר אחד כדי TRAהספירה התאים עם ביטוי של גנים מושתלים ולחקור את יחסי הגומלין של גנים שונים בהיווצרות מחלה בבעלי החיים הפסיפס ^31. כהוכחה לעיקרון, אנחנו זמניים ביטוי יתר ALK מופעל mutationally (F1174L) עם גן כתב mCherry במערכת העצבים הסימפתטית ההיקפית (PSNS) תחת שליטה של hydroxylase בטא דופמין (βh ד) האמרגן בדגי פרא-סוג ודג מהונדס ביתר MYCN. ALK, אשר מקודד טירוזין קינאז קולט, הוא הגן שעבר מוטציה הנפוצות ביותר בנוירובלסטומה בסיכון גבוה ^5-7,32,33. ALK (F1174L), כאחד מהמוטציות סומטיות הפעלה התכופות והחזקות ביותר, הוא ייצוג-יתר ב MYCN- מוגבר חולי נוירובלסטומה בסיכון גבוה וsynergizes עם ביטוי יתר MYCN להאיץ יצירת גידולי נוירובלסטומה בשני עכברים הטרנסגניים יציבים ודגמי דג הזברה מהונדסים ^8,34,35. על ידי פסיפסביטוי יתר חולף של ALK (F1174L) עם mCherry בדג המהונדס MYCN, אנחנו סכמנו האצת תחילת גידול שנצפתה בדגים מהונדסים יציבים ביתר שני ALK (F1174L) וMYCN, המצביע על כך את אסטרטגית transgenesis פסיפס יכולה לשמש למהירות וביעילות להעריך את התרומה היחסית של אונקוגנים רבים בייזום גידול in vivo.