Tam İkili Gill Denervasyonun ile birleştiğinde A Time Diferansiyel Boyama Tekniği Balık Ionocytes Eğitim için
Summary
This manuscript describes a protocol to track the re-distribution of branchial ionocytes and their innervation using a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation.
Abstract
Brankiyal ionocytes (IC) balık iyonik düzenleme için işlevsel birimlerdir. Yetişkinlerde, onlar solungaç ve filamental ve katmanlı epitel bulunan nerede Na +, Cl gibi onlar ulaşım iyonları – iyon kanalları, pompa ve eşanjör çeşitli yoluyla ve Ca 2+. teleost solungaç dışsal glossofaringeal (IX) ve vagus (X) sinirler (VI) yüz tarafından innerve edilir. IX ve X sinirler de brankiyal IC innervasyon dışsal kaynağıdır. Burada, innervasyonu, çoğalmasını ve IC dağılımını incelemek için kullanılan iki teknik tarif edilmiştir: Bir zaman diferansiyel boyama tekniği ve tam ikili solungaç denervasyon tekniği. Kısaca, akvaryum balığı hayati mitokondri özel boya maruz (örn, MitoTracker Kırmızı) etiketler (kırmızı floresan) önceden varolan IC. Balık ya da 3 için eski hallerine gelmeye bırakılmıştır – 5 gün ya da hemen tam bir ikili solungaç denervasyon uygulandı. 3 Sonra – kurtarma 5 gün, gdertlerin hasat ve immünohistokimya için sabittir. Doku daha sonra, bir α-5 birincil antikor ile boyanmış olan (hedef hücreleri ihtiva eden + / K + ATPaz Na) Tüm (hem yeni hem de önceden var olan) IC yeşil etiket ikincil bir antikor ile birlikte kullanılabilir. Konfokal görüntüleme kullanarak, önceden varolan IC ve yeni ICS (bir canlı mitokondri özel boya ve α-5 hem de etiketli) sarı görünür (α-5 yalnızca etiketli) yeşil görünür olduğu gösterilmiştir. Tandem kullanılan iki teknik balık çevre sorunlarına maruz kaldığında solungaç filamanın üzerindeki IC innervasyonu, çoğalmasını ve dağıtım çalışma uygulanabilir.
Introduction
IC balık iyonik düzenleme için işlevsel birim ve solungaç filamentlerin epitel yüzeylerde bulunan ve 4,6-8,10 lamelleri. Alt tipler benzersiz özelliklere sahip olduğu tarif edilmesine rağmen, IC birçok mitokondri yüksek yoğunluklu (böylece aynı zamanda mitokondri zengin hücreler olarak da bilinir) ve / veya enzimin bolluğu ile karakterize edilen, Na + / K + ATPaz (NKA). Tipik olarak, bu IC ev iyon düzenleme (örneğin, Na + / H + değiştirici, Na / Cl – ko-transporter H + pompa) 'de yer alan diğer pompalar, iyon kanalları ve değiştiricilerin çeşitli 2,10,11. bir telafi mekanizması olarak IC dağıtılması ve yayılması özellikle iyonik stres (örneğin, iyon-fakir suya maruz kalma) 4,8,9 sırasında iyon dengesini sağlamaya yönelik merkezi.
Bu çalışma, bir zaman diferansiyel boyama Techni açıklarque 1 balık solungaçları yeni çoğaldı ionocytes (IC) tanımlamak için. Bu teknik, solungaç kemerler tam bir ikili denervasyon ile birleştirilmiştir. Balığı (Carassius auratus), bu çalışmalarda kullanılan türler, yapısal olarak kendi solungaçları 2 yeni model için önemli bir özelliğine sahiptir, çünkü solungaç epitel hücrelerin çoğalmasını çalışma için uygundur. Soğuk su (<15 ° C) ya da, oksijen azalması, sırasıyla 3 ortama alıştırılır – Gill yeniden modelleme (30 ° C, normal olarak 15 de muhafaza edilmiş) balık bir interlameller hücre kitlesinin büyümesine ve geri çekilmesi (ILCM) belirtir. Goldfish zamanı diferansiyel boyama tekniği kullanılarak Önceki çalışmalar 4,5 biçimlenme solungaç bağlamında solungaç üzerindeki IC dağıtılması, innervasyon ve çoğalması üzerine odaklanmıştır. Katoh ve Kaneko 1 killifish dönüşümü ve brankial IC değiştirilmesini incelemek için bu yeni tekniği geliştirdi (Fundulus heteroclitus) transfeTemiz su (FW) deniz suyu (SW) ile ilgili rred. Bu çalışmada, odak noktası 25 ° C alıştırıldı akvaryum balığı IC çoğalması ve innervasyonunu üzerindedir.
Gill yeniden bağlamında, bu gösterilen süre farkı boyama tekniği kullanılarak, akvaryum balığı hipoksik maruz kalma ve takip eden normoksik geri kazanımı sırasında ICs sabit sayıda muhafaza, bununla birlikte, inerve hücrelerin yüzdesi normoksik iyileşme dönemi 5 boyunca azalmıştır. Bu nöral kontrol altında 12 fazla 70 yıl önce balık iyonik alım mekanizmaları olduğu ileri sürülmüştür. teleost solungaç da "brankiyal sinirler" 13,14 olarak anılacaktır yüz (VII), dil ve yutak (IX) ve vagus (X) sinirler tarafından innerve edilir. Zebra balığı üzerine Jonz ve Hemşire (2003) tarafından yürütülen çalışmalar (Danio rerio) solungaç innervasyon innervasyon kökeni dışsal (hücre gövdesi (sinir lifi hücre gövdesi solungaç için dışsal olan) yanı sıra içsel olduğunu gösterdisinir lifi) solungaç özgüdür. Aynı yazarlar da brankiyal IC dışsal 7 innerve olduğunu göstermiştir.
Bu çalışmada, tam iki taraflı solungaç denervasyon ile birleştiğinde zaman diferansiyel boyama tekniği akvaryum balığı olarak dışsal innervasyon eksik IC çoğalmasını araştırmak için kullanıldı. Narin cerrahi prosedürler kolaylaştırır ve ionocytes kolayca standart immunohistokimyasal teknikler kullanılarak tanımlanır – Tam ikili solungaç denervasyon kranial sinirler IX ve X. nispeten büyük boy (200 gr 30), çünkü bu iki yaklaşım akvaryum balığı uygulanabilir olan kesilmesinin anlamına gelir. Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası, University Mevcut çalışmada, IC (ör MitoTracker Kırmızı) önemli bir mitokondri özel bir boya ya da Na + / K + -ATPaz (α-5 α-alt birimlerine karşı birincil antikor kullanılarak görselleştirilmiştir Iowa, Iowa City IA). Bu protokol, basit bir yöntemii sağlargörselleştirme ve balık solungaç üzerindeki IC yeniden dağıtılmasını ve çoğalmasını analiz d.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zaman diferansiyel boyama tekniği iyon alımı dinamik düzenleme anlamak ve solungaç epitel IC zamansal yeniden dağılımını incelemek için yararlı bir araç olabilir. Basit bir prosedür olmasına rağmen, zaman diferansiyel boyama tekniğinin başarısı için önemlidir kilit noktaları vardır. goldfish protokolünde ayrılan zaman için mitokondri zengin boya maruz gerekir. Daha kısa maruz mitokondri zengin hücreler (yani, ionocytes) ile boyanın zayıf emme ile sonuçlanacaktır. Tespit sırasında, solungaç dokusu hızla eksize edilmeli ve fotoğraf beyazlatma önlemek için karanlıkta tuttu. Doku tespitin 2 hafta içinde görüntüleme için işlenmiş olması gerekir. İkili sinir kesit işlemi sırasında balık iyi anestezi olduğundan emin; sinirler ve kan damarları açıkça belirlenmiştir; Bir kurtarma tankına taşınmadan önce ve balık dolu operkuler işlevini sürdürür.
"> FW ortamı. Pasif iyon kayıpları ve ozmotik su kazancı 14 dengeleme ikili mücadeleden ile balık sunan pasif iyon kayıplarının dengelenmesi filamental ve lameller epitel onlar lokalize olan IC genelinde tuz aktif alımı yoluyla gerçekleşir dış çevre 2,4,8,9,16 ile doğrudan temas. Ancak, solungaç üzerindeki IC yeri statik değildir. Son üç yılda bir dizi çalışma bu birkaç FW balık türleri göstermiştir, karşı karşıya Bir iyonik ve / veya ısı meydan, ince tabakanın 1,2,4,5,17-21 daha uzak bölgelere lamelinin filaman veya bazdan brankiyal ICs dağıtmak. Bu tür bir yeniden dağıtım lamellerinin kalınlığı artırabilen Gaz transferi bozabilir (O 2, CO 2) 22. Araştırmacılar bu yazıda anlatılan zaman diferansiyel boyama tekniği kullandık solungaç epitel boyunca tehcir ve emergenc izlemek içinBu farklı deneysel koşullar (Şekil 1C) 1,4,5 altında solungaç epitel yeni IC e.solungaçları ve muhtemelen brankial IC, IX ve X, kranial sinirler 7,23-25 tarafından innerve edilir. Bu sinirler, sırasıyla, ve solungaç gelen efferent ve afferent girdiler hem de taşırlar. Onlar 4. solungaç kemer arkasında ağız boşluğuna dorsal tarafında yer almaktadır. sinirler ve ikili denervasyon işlemi yapılabilir hangi ile kolaylığı erişilebilirlik türe özeldir. Sinir doku ince bir tabaka altında 4. solungaç kemeri arkasında, tek bir düzlem üzerinde uzanmamaktadır için alabalık, örneğin, kafa sivri ve düzleştirilmiş anatomi sağlar. Bu sinirler görünür ve denervasyon yordamı gerçekleştirmek için araştırmacı kolayca erişilebilir hale getirir. Buna karşılık, akvaryum balığı kısa burun ve yuvarlak kafa var. Japon balıklarının IX ve X kranial sinirler dorsal si derinliklerine yalanFarklı uçakları işgal 4. solungaç kemer sonra kavite de. Bu yönelim sinirlerin erişim kolaylığı sınırlar ve uygun sinirleri belirlemek ve sever bir daha dikkatli bir yaklaşım gerektirir. denervasyon prosedürünün amacı, sırasıyla, ve solungaç duyu afferent ve efferent giriş kaldırmaktır. Solungaç kemeri denervasyonu da radyoizotopların iyon akışı deneyleri (örneğin, 22 Na) ile akuple edilebilir. Bu teknikler solungaç epitel boyunca iyon hareketi sinir giriş katkısını incelemek için tandem kullanılabilir. Denervasyon prosedürü başka sınırlama sinir kesilmesinin böylece zaman, duyusal ve motor nöronlar arasında ayrım bu innervasyon iki tip kaldırılır ediliyor mümkündür paket yetersizlik. Herhangi bir motor nöronları tomar balık solungaç ve operkuler hareketini etkileyebilir. Solungaç denervasyon deneyler yaparken Böylece de sonra havalandırmayı izlemek için önemlidirBalık gazı ve iyon değişimi hem de yeterli solungaç hareketi var olduğundan emin olmak için prosedür kurtarıldı.
karanlık döngüsü ve beslenen ticari gıda pelet: Bu yazının kullanım yetişkin hayvanlarda açıklanan protokoller 12:12 ışık tuttu. Bu yöntemler, çeşitli şekillerde değiştirilebilir. İlk olarak, mitokondri zengin boya maruz kaldıktan sonra iyileşme süresi, araştırmacının protokol (örneğin, 1, 3, 5, veya 14 gün) gereklerine göre ayarlanabilir. Laboratuvarda mitokondri zengin boya maruz kaldıktan sonra iyileşme uzun süre 14 gün 4,5 olmuştur. Iyileşme 14 gün sonra mitokondri zengin boyanın floresan yoğunluğunda önemli bir azalma oldu. İkincisi, α-5 birincil antikor kullanımı sadece NKA zengin hücrelerin belirlenmesi ve brankial IC farklı alt tipleri arasında ayrım yapmaz sınırlıdır. IC çoğunluğu her iki mitochondr olduğunu Neyse, akvaryum balığı o kurulduiyon zengin (Mitotracker etiket) ve tüm balık türlerinin 4,27 durumda olmayabilir hücreler (α-5 etiket) NKA zengin. Gelecek deneyler kanalları, pompa ve eşanjör (örneğin, NHE, H + pompa) çeşitli karşı özellikle yönlendirilmiş antikorlar kullanarak belirli IC alt tiplerinin zamansal yeniden dağıtılması aşağıdaki odaklanabilirsiniz. Önceki çalışmalar bulduğu mitokondri zengin boya sergi NKA immünoreaktivitesinde 4 ile boyanmış ionocytes çoğunluğu. IC İnnervasyonu zebra balığı türetilmiş nörona özgü antijen (Zn-12) karşı birincil antikor kullanılarak tespit edilebilir. Bu çalışmada,-5 α ve zn-12 birincil antikorlar için aynı ikincil antikoru (Alexa Fluor 488) ile tespit edilmiştir. Her iki birincil antikorlar bir fare konakta gündeme getirilen ve NKA zengin hücreler ve nöronlar aynı renk floresan bile morfolojik ayırt edilebilir olması ile aşılır Bu sınırlama nedeniyle. Sıralı boyamaFarklı ikincil antikorlarla (Alexa Fluor 488 ile, örneğin, ilk α-5 Alexa Fluor 594 ile-12 zn) da aynı renk floresanlama iki belirteçleri olan sorununu ortadan kaldırmak için kullanılabilir. Son olarak, tam iki taraflı sinir kesit protokole özgü solungaç kemerler sinirleri hedef modifiye edilebilir. Örneğin, seçici sinir kesit hafifçe solungaç sepeti (Şekil 2B-E) dorsal sonunda birinci solungaç kemer giden sinirleri açığa birinci ve ikinci solungaç kemeri ayırarak birinci solungaç kemer yapılabilir. Zaman diferansiyel tekniği aynı zamanda geliştirmek ve solungaç deriden iyon taşıma geçişler gibi larva Zebra balığı balık ionocytes dağılımını incelemek için uygulanabilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank William Fletcher for animal care at the University of Ottawa. The authors would also like to thank Dr. William Milsom for teaching VT the full bilateral denervation technique at the University of British Columbia. A travel grant for this research was provided by the Faculty of Graduate and Postgraduate Studies at the University of Ottawa. This research is also supported by NSERC PGS-D scholarship to VT and Discovery Grants Program to SFP.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| MitoTracker Red | Life Technologies | M-7512 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Alrdich | D2650 | |
| α-5 primary antibody | Develompental Hybridoma Bank | a5 | |
| zn12 primary antibody | Develompental Hybridoma Bank | zn12 | |
| Alexa Fluor 488 (anti mouse) | Life Technologies | A-11001 | |
| Benzocaine | Sigma Alrdich | E1501 | 4-Aminobenzoic acid ethyl ester, Ethyl 4-aminobenzoate |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | straight |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | curved |
| Dumont No. 5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Tissue retractor | Fine Science Tools | 17009-07 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Alrdich | P6148 | |
| Triton X | Sigma Alrdich | X100 | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Katoh, F., Kaneko, T. Short-term transformation and long-term replacement of branchial chloride cells in killifish transferred from seawater to freshwater, revealed by morphofunctional observations and a newly established ‘time-differential double fluorescent staining’ technique. J. Exp. Biol. 206 (22), 4113-4123 (2003).
- Perry, S. F. Relationships between branchial chloride cells and gas transfer in freshwater fish. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 119 (1), 9-16 (1998).
- Sollid, J., Weber, R. E., Nilsson, G. E. Temperature alters the respiratory surface area of crucian carp Carassius carassius and goldfish Carassius auratus. J. Exp. Biol. 208 (6), 1109-1116 (2005).
- Mitrovic, D., Perry, S. F. The effects of thermally induced gill remodeling on ionocyte distribution and branchial chloride fluxes in goldfish (Carassius auratus). J. Exp. Biol. 212 (6), 843-852 (2009).
- Tzaneva, V., Vadeboncoeur, C., Ting, J., Perry, S. F. Effects of hypoxia-induced gill remodelling on the innervation and distribution of ionocytes in the gill of goldfish, Carassius auratus. J. Comp. Neurol. 522 (1), 118-130 (2014).
- Greco, A. M., Fenwick, J. C., Perry, S. F. The effects of soft-water acclimation on gill structure in the rainbow trout Oncorhynchus mykiss. Cell Tissue Res. 285 (1), 75-82 (1996).
- Jonz, M. G., Nurse, C. A. Epithelial mitochondria-rich cells and associated innervation in adult and developing zebrafish. J. Comp. Neurol. 497 (5), 817-832 (2006).
- Laurent, P., Hebibi, N. Gill morphometry and fish osmoregulation. Can. J. Zool. 67 (12), 3055-3063 (1989).
- Perry, S. F., Laurent, P. Adaptational responses of rainbow trout to lowered external NaCL concentration: contribution of the branchial chloride cell. J. Exp. Biol. 147, 147-168 (1989).
- Evans, D. H., Piermarini, P. M., Choe, K. P. The multifunctional fish gill: dominant site of gas exchange, osmoregulation, acid-base regulation, and excretion of nitrogenous waste. Physiol. Rev. 85 (1), 97-177 (2005).
- Hwang, P. P., Lee, T. H., Lin, L. Y. Ion regulation in fish gills: recent progress in the cellular and molecular mechanisms. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 301 (1), R28-R47 (2011).
- Krogh, A. The Active Uptake of Ions into Cells and Organisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 25 (6), 275-277 (1939).
- Nilsson, G. E., Randall, D. J., Hoar, W. S. Innervation and pharmacology of the gills. Fish Physiology. , 185-272 (1984).
- Sundin, L., Nilsson, S. Branchial innervation. J. Exp. Zool. 293 (3), 232-248 (2002).
- Dymowska, A. K., Hwang, P. P., Goss, G. G. Structure and function of ionocytes in the freshwater fish gill). Respir. Physiol. Neurobiol. 184 (3), 282-292 (2012).
- Witters, H., Berckmans, P., Vangenechten, C. Immunolocalization of Na+/K+-ATPase in the gill epithelium of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Cell Tissue Res. 283 (3), 461-468 (1996).
- Bindon, S., Fenwick, J. C., Perry, S. F. Branchial chloride cell proliferation in the rainbow trout, Onchorhynchus mykiss: implications for gas transfer. Can. J. Zool. 72 (8), 1395-1402 (1994).
- Bradshaw, J. C., Kumai, Y., Perry, S. F. The effects of gill remodeling on transepithelial sodium fluxes and the distribution of presumptive sodium-transporting ionocytes in goldfish (Carassius auratus). J. Comp. Physiol. B. 182 (3), 351-366 (2012).
- Chou, M. Y., et al. Effects of hypothermia on gene expression in zebrafish gills: upregulation in differentiation and function of ionocytes as compensatory responses. J. Exp. Biol. 211 (19), 3077-3084 (2008).
- Kaneko, T., Katoh, F. Functional morphology of chloride cells in killifish Fundulus heteroclitus, a euryhaline teleost with seawater preference. Fisheries Science. 70 (5), 723-733 (2004).
- Ouattara, N., et al. Changes in gill ionocyte morphology and function following transfer from fresh to hypersaline waters in the tilapia Sarotherodon melanotheron. Aquaculture. 290 (1-2), 155-164 (2009).
- Bindon, S., Gilmour, K., Fenwick, J., Perry, S. The effects of branchial chloride cell proliferation on respiratory function in the rainbow trout, Oncorhynchusmykiss. J. Exp. Biol. 197 (1), 47-63 (1994).
- Dunel-Erb, S., Bailly, Y., Laurent, P. Pattern of gill innervation in two teleosts, the perch and the trout. Can. J. Zool. 71, 18-25 (1993).
- Jonz, M. G., Nurse, C. A. New developments on gill innervation: insights from a model vertebrate. J. Exp. Biol. 211 (15), 2371-2378 (2008).
- Jonz, M. G., Zaccone, G. Nervous control of the gills. Acta Histochem. 111 (3), 207-216 (2009).
- Milsom, W. K., Reid, S. G., Rantin, F. T., Sundin, L. Extrabranchial chemoreceptors involved in respiratory reflexes in the neotropical fish, Colossoma macropomum (the tambaqui). J. Exp. Biol. 205 (12), 1765-1774 (2002).
- Hwang, P., Lee, T. New insights into fish ion regulation and mitochondrion-rich cells. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 148 (3), 479-497 (2007).
