Una técnica de tinción diferencial Tiempo Junto con Full Bilateral Gill Desnervación para estudiar Ionocytes en Fish

Ambos protocolos se ajustaban a las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales (CCPA) y se llevaron a cabo con la aprobación de la Universidad de Comité de Cuidado de Animales de Ottawa (Protocolo BL-226). Técnica 1. Tiempo diferencial de tinción: Mitocondria rico tinte Bath Preparar solución madre 1 mM MitoTracker Red disolviendo 50 g en 94,0 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO al 100%). Mantenga solución madre en la oscuridad a -20 ° C cuando no esté en uso. Evite los ciclos de congelación / descongelación. Preparar cajas oscuras (3-6 cajas) con un volumen máximo de 600 ml. Llene las cajas con 400 ml de agua del sistema (agua el pescado normalmente se celebran en) y colocar un difusor de aire en cada caja para proporcionar una fuente de O 2. Obtener peces de colores (30 – 40 g) y colocarlos en las cajas con 400 ml de agua y un difusor de aire. Después de 30 min, añadir el colorante mitocondria ricos viable para producir concentraciones finales de 0,1 M y 0,01% de DMSO. Lavar el pescado durante 4 hr. Si estos son peces de control (es decir, sin denervación), encienda el flujo de agua a las cajas, permita que el medio de contraste para enjuagar ya recuperar los peces durante el periodo de tiempo establecido en el protocolo. Los peces son normalmente recuperados para 3-5 días. Después de que el período de recuperación proceda a la Sección 3: Tiempo diferencial Técnica de maquillaje: La inmunohistoquímica. Si estos peces deben ser denervado proceda a la Sección 2: Completo Procedimiento denervación bilateral. 2. Procedimiento denervación bilateral completa Obtener 1 par de tijeras de estudiantes Vannas primavera (curvas), 1 par de pinzas-rectas patrón estándar, 1 par de fórceps curvas patrón estándar, 2 pares de No. 5 fórceps, 1 par de retractores de tejidos, bolas pequeñas de algodón (1 – 2 mm de diámetro), y los hisopos de algodón (Q Consejos o equivalentes). Preparar el baño de agua anestésico. En primer lugar, se disuelven 10 g de benzocaína a un volumen final de 100 mlde 99% de etanol para preparar una solución madre. Para preparar el baño de agua anestésico, se disuelven 15 ml de la solución madre benzocaína en 30 L de agua del sistema aireado a la temperatura requerida. Airear el agua mediante la colocación de una piedra de aire conectado a una bomba de aire o una línea central de aire en el tanque de agua. Coloque el pescado en el baño de agua anestésico (Figura 1). Una vez que ha cesado la respiración, coloque el pescado en una mesa de cirugía y intubar como se muestra en la Figura 1B. Para ello, la inserción de un tubo en su cavidad bucal para el riego de las branquias con solución anestésica aireado. El riego de las branquias asegura que el pescado se suministra con una cantidad suficiente de O 2 y el anestésico durante el procedimiento de denervación. Coloque el pescado de modo que la cabeza se inclina ligeramente hacia abajo. Esto permite un mejor acceso a la zona detrás del cuarto arco branquial. Levante con cuidado el opérculo con las pinzas de patrones estándar rectasy colocar los retractores de tejido entre el opérculo y el interior de la cabeza. Abra cuidadosamente los retractores de tejido para mantener el opérculo lejos de la cabeza y mantener las branquias expuestas. Asegúrese de que la solución anestésica se regando las branquias durante este procedimiento. Descansa el retractor maneja al lado de la cabeza, que proporciona acceso a los cuatro arcos branquiales. Colocar las pinzas curvas patrón estándar entre el cuarto arco branquial y la parte posterior de la cabeza y suavemente abrirlos para crear tensión en el ligamento de fijar el cuarto arco branquial a la cabeza. Con un par de fórceps No. 5 crean una pequeña abertura (2-3 mm) por la perforación del epitelio que conecta el extremo dorsal de los arcos branquiales a la cavidad opercular. Tenga cuidado de no ir demasiado profundo, porque se corre el riesgo de dañar un vaso sanguíneo principal. Con una pequeña bola de algodón celebrada con el número 5 fórceps lenta y cuidadosamente expandir la incisión para exponer el IX (glosofaríngeo) y X (vago) nervios. Libertad para losnervios de cualquier tejido conectivo mediante el No. 5 fórceps, de nuevo con cuidado de no dañar los vasos sanguíneos. NOTA: El IX y X branquial nervios de los peces de colores descanso profundo detrás del cuarto arco branquial y están en proximidad a los principales vasos sanguíneos que alimentan a los arcos branquiales. Una vez que los nervios se han identificado el uso de las tijeras de primavera curvas para cortar cuidadosamente los nervios, mientras que la celebración de la incisión abierta con las pinzas de la forma estándar de curvas. Después de cortar los nervios, retraiga suavemente las pinzas curvas. No hay necesidad de cerrar la incisión con puntos de sutura debido a que el epitelio es muy delgada y la incisión se cierra generalmente en solitario dentro de 24 a 48 h. Eliminar retractor de tejido. Repetir el mismo procedimiento en el otro lado de la cabeza. Cambie el riego de las branquias de anestésico para agua gaseosa fresca para recuperar los peces de la anestesia. Una vez que los movimientos operculares han reanudado mover los peces en tanques experimentales de recuperar por lo menos durante 24 horas. <li> Realizar un procedimiento de "farsa" en un conjunto separado de pescado. El procedimiento de "farsa" implica perforar el epitelio detrás del cuarto arco branquial sin cortar los nervios. 3. Tiempo diferencial Técnica de maquillaje: La inmunohistoquímica En primer lugar, preparar 4% de paraformaldehído (PFA) en 1x tampón fosfato salino (PBS; 4 g PFA en 96 ml de PBS). PFA no se disuelve fácilmente en PBS a RT. Solución de calor en un baño de agua para disolver PFA. Realice esto en una campana de humos. Una vez PFA está en solución dejar enfriar antes de su uso. Almacenar a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas. Antes de la eutanasia de los peces y la extracción del tejido branquial, coloque 3 – 4 ml de PFA al 4% en un vial de centelleo para un total de 8 viales de centelleo (1 vial por arco branquial). Además, tomar un pequeño barco pesa y lo rellenamos con 1x PBS. Esto se utiliza para lavar el tejido después de que ha sido extirpado. Mantenga todas las soluciones en hielo. Después de la exposición viable colorante mitocondria ricosexperimento ha terminado, la eutanasia los peces de colores, colocándolo en un baño de agua con una sobredosis de la benzocaína. El uso de fórceps romos para levantar el opérculo en un lado de la cabeza y tijeras curvas para cortar cada extremo de la cesta Gill branquial. Recoja cuidadosamente las branquias de los rastrillos utilizando fórceps romos y sacarlos de la cavidad opercular. Lave inmediatamente las branquias en el hielo frío 1x PBS para eliminar el exceso de benzocaína y la sangre. Coloque las branquias extirpadas, en viales separados (un vial para cada arco branquial) llenos de PFA al 4% y fijar O / N a 4 ° C. Después de la fijación, se lava el exceso de PFA en 1X PBS y colocar el tejido en un tubo bullet 2 ml lleno con 1,5 ml de 1% de Triton-X en un agitador durante 6 h a RT o O / N a 4 ° C. Este paso permeabiliza el tejido. Si toda la papada es demasiado grande como para colocar en un tubo de 2 ml a continuación, cortar el tejido en secciones lo suficientemente pequeños para encajar el tubo con cuidado de no dañar los filamentos. Preparar las diluciones de anticuerpos primarios por mixing 4 l de la solución madre de cada anticuerpo primario (un total de 8 l) en 992 l de PBS 1x. Asegúrese de que la NKA (etiquetas de células NKA-ricos) y Zn-12 (etiquetas neuronas) anticuerpos primarios se han planteado en el mismo host. Esto es importante si los investigadores deciden identificar subtipos específicos de CI al mismo tiempo por el que tendrán que utilizar anticuerpos primarios y secundarios se plantean en una especie huésped diferentes. Eliminar la solución de Triton-X y sin lavar el tejido poner una dilución 1: 250 (diluido en PBS 1x) de un anticuerpo monoclonal NKA (α-5) para detectar las células NKA-ricos y un anticuerpo específico neuronal pez cebra (Zn-12) para detectar las fibras nerviosas (anticuerpos primarios) y se incuba en un agitador durante 6 horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. Lave el anticuerpo primario 3 veces durante 3 minutos cada uno utilizando 1x PBS. Para ello, retire la solución de anticuerpo primario del tubo de aspiración a cabo utilizando una pipeta. Preparar el anticuerpo secundario a una1: 200 dilución mediante la mezcla de 5 l de anticuerpo secundario de stock en 995 l de PBS 1x. Aplicar el anticuerpo secundario (Alexa Fluor 488) e incubar durante 6 horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C en un agitador. NOTA: MitoTracker Roja se excita a un ~ 594 nm de longitud de onda y será fluorescente roja. Un anticuerpo secundario que se excita a una ~ 488 nm de longitud de onda y emite fluorescencia verde debe ser utilizada para etiquetar NKA y Zn-12 anticuerpos primarios. Eliminar el exceso de anticuerpo secundario lavando el tejido 3 veces durante 5 minutos cada uno (como se describe en el paso 3.7). 4. Imaging Después de los lavados, monte el tejido en un portaobjetos cóncavo para toda montar imagen confocal de células y fibras nerviosas. Para montar el tejido, primero colóquelo en una gota (200 l) de 1x PBS en un portaobjetos de microscopio plana. Esto asegura que el tejido no deseque. Separe las hemibranquias enmalle con las curvas micro-tijeras. Colocar una gota de PBS 1x y una gota de medio de montaje en una diapositiva cóncava. Coloca los hemibranquias separados en la diapositiva cóncava con el borde delantero del filamento hacia arriba y cubrir con un cubreobjetos. Dab los bordes de la hoja de la cubierta con esmalte de uñas con el fin de evitar que la hoja de la cubierta se mueva alrededor y desplazando el tejido. Permitir que el tejido se asiente a la parte inferior de la corredera cóncava para de 10 – 15 min antes de formación de imágenes. Para cada arco branquial, seleccionar seis filamentos branquiales al azar para la imagen, produciendo seis imágenes por arco branquial. Uso de la microscopia confocal convencional a la imagen del tejido mediante la adopción de 1 – 3 micras rodajas ópticos. NOTA: Cualquier células preexistentes será etiquetado con MitoTracker Roja y positivo para NKA aparecerá amarilla solamente. Las células que aparecen de color rojo sólo son ICs preexistentes que no contienen NKA. Cualquier célula recién proliferado sólo será positivo para NKA y aparecerá verde solamente. Las fibras nerviosas también aparecerán de color verde. 5. Análisis de Imágenes para Ionocyte Cuantificación Para each filamento branquial que ha sido fotografiado, cuantificar los circuitos integrados y la inervación asociado desplazándose a través de las secciones de la pila Z y contando el número de lamelares y filamentoso ICs presente y si son o no son de nueva diferenciados, preexistente y / o inervado . Cuantificar los ICs por filamento o por zona (mm 2) de filamento. Para ello debe utilizar las herramientas de dibujo asociados con el software utilizado para adquirir las imágenes para delinear las láminas del filamento que abarca la zona del filamento en la que se cuantificaron los ICs. La mayoría de los programas de software de imagen confocal tienen la opción de calcular el área de una región se indica en la imagen. Utilice la opción en el software de imágenes que te permite hacer esto para adquirir la zona. Divida a los ICs contadas por el área calculada por el software para obtener una medida de ICs por unidad de área (por ejemplo, por 2 mm).