Время дифференциальной окраски Техника сочетании с полноценного двустороннего Gill денервации для изучения Ionocytes в Рыбок

Оба протокола соответствовала руководящим принципам Канадского совета Уходу за животными (ССАС) и были проведены с одобрения университета Оттавы комитета по уходу за животными (Протокол BL-226). 1. Время дифференциальной окраски Техника: Митохондрия богатых Краска Ванна Подготовка 1 мМ Mitotracker Red маточного раствора путем растворения 50 мкг в 94,0 мкл диметилсульфоксида (100% ДМСО). Держите маточного раствора в темноте при -20 ° С, когда он не используется. Избегайте циклов замораживания / оттаивания. Подготовка темные коробки (3 – 6 ящиков) с максимальным объемом 600 мл. Заполните ящики с 400 мл воды в системе (вода рыб обычно проводятся в) и поместите воздушный камень в каждой коробке, чтобы обеспечить источник O 2. Получить золотую рыбку (30 – 40 г) и поместите их в коробки с 400 мл воды и воздуха камня. Через 30 мин добавить жизнеспособной митохондрии богатые краситель с получением конечных концентраций 0,1 мкМ и 0,01% ДМСО. Купайтесь рыбу в течение 4 чр. Если это контроль рыба (т.е., не денервация), включите расхода воды в боксы, позволяют краситель, чтобы избавиться от и восстановить рыбу на период времени, отведенный в протоколе. Рыба, как правило, восстанавливается в течение 3 – 5 дней. После периода восстановления перейдите к разделу 3: Время дифференциальной окраски Техника: иммуногистохимии. Если эти рыбы должны быть денервированные перейдите к разделу 2: Полноценного двустороннего Порядок Денервационная. 2. полноценного двустороннего Порядок Денервационная Получить 1 пару студенческих Vannas весенних ножницами (изогнутые), 1 пара стандартных шаблонов щипцов и гетеросексуалов, 1 пара стандартных шаблонов щипцов с загнутыми, 2 пары № 5 щипцы, 1 пара тканей преднатяжителями, небольшой ватные шарики (1 – 2 мм в диаметре), и ватные тампоны (Q Советы или эквивалент). Подготовка анестезии водяную баню. Во-первых, растворяют 10 г бензокаин до конечного объема 100 млиз 99% этанола с получением исходного раствора. Для приготовления анестезирующего ванну воды, растворяют 15 мл на складе бензокаин раствора в 30 л газированной воды системы при требуемой температуре. Аэрации воды, поместив воздушный камень, соединенный с воздушным насосом или центральной воздушной линии в резервуар с водой. Поместите рыбу в анестезиологической водяной бане (рис 1А). После того, как дыхание прекратилось, положите рыбу на хирургический стол и интубация его, как показано на рисунке 1В. Сделайте это, вставив трубку в его ротовой полости для орошения жабры с газированной анестезией. Орошение жабры гарантирует, что рыба подается с достаточным количеством О 2 и анестетика во время процедуры денервации. Расположите рыбу так, чтобы голова слегка наклонена вниз. Это позволяет для лучшего доступа к области за четвертый арки жаберных. Аккуратно поднимите крышечку с прямой стандартная схема щипцови поместите тканей преднатяжителями между крышечкой и внутренней части головы. Осторожно откройте тканей преднатяжителями, чтобы сохранить крышечку от головы и держать жабры открытые. Убедитесь, что анестезирующий раствор в полива жабры во время этой процедуры. Отдых втягивающее ручки рядом с головой, которая обеспечивает доступ ко всем четырем жаберных дуг. Поместите изогнутые стандартная схема щипцы между четвертой арки жаберных и затылок и осторожно открыть их, чтобы создать напряжение в связки, крепящие четвертый жаберные дуги в голову. С парой № 5 щипцы создается небольшое отверстие (2 – 3 мм) путем прокалывания эпителий, соединяющий спинной части жаберных дуг в оперкулярной полости. Будьте осторожны, чтобы не идти слишком глубоко, потому что есть риск повреждения основной кровеносный сосуд. С небольшим ватным тампоном, состоявшейся с № 5 щипцы медленно и осторожно расширить разрез, чтобы выставить на IX (языкоглоточного) и Х (блуждающих) нервов. Бесплатныйнервы от любой соединительной ткани с помощью № 5 щипцы, опять стараясь не повредить кровеносные сосуды. ПРИМЕЧАНИЕ: жаберная IX и X нервов золотая рыбка отдохнуть в глубоком тылу четвертого арки жабры и в непосредственной близости от крупных кровеносных сосудов, питающих в жаберных дуг. После того, как нервы были определены Используйте изогнутые пружинные ножницы, чтобы тщательно вырезать нервы, удерживая разрез открытый с изогнутыми стандартных щипцов формы. После разрыва нервы, аккуратно сворачивая изогнутые щипцы. Там нет необходимости, чтобы закрыть разрез со швами, поскольку эпителий очень тонок и разрез обычно закрывает по себе в течение 24 – 48 ч. Удалить тканей втягивающим. Повторите ту же процедуру с другой стороны головы. Включите орошения жабр от анестезии на свежий газированной воды, чтобы восстановить рыбу из анестезии. После того, как Крышечные движения возобновили перемещения рыбы в экспериментальных танков, чтобы восстановиться, по крайней мере, 24 ч. <lя> Выполнить процедуру "липовый" на отдельном наборе рыбы. Процедура "обман" включает в себя пирсинг эпителий за четвертый арки жаберных без отсечения нервы. 3. Время дифференциальной окраски Техника: Иммуногистохимия Во-первых, получение 4% параформальдегида (PFA) в 1X фосфатным буферным раствором (PBS, 4 г PFA в 96 мл PBS). PFA не легко растворяются в PBS при комнатной температуре. Тепло раствор на водяной бане до растворения PFA. Выполните это в вытяжном шкафу. После того, как PFA в растворе дайте остыть перед использованием. Хранить при 4 ° С в течение 2 недель. Перед эвтаназии рыбу и извлечения жаберные ткани, 3 место – 4 мл 4% PFA в сцинтилляционный флакон на общую сумму 8 сцинтилляционные флаконы (1 флакон на жаберной дуги). Кроме того, принять небольшой вес лодки и заполнить его с 1x PBS. Эта информация будет использоваться для мытья ткани после того, как вырезали. Держите все решения на льду. После выдержки красителя жизнеспособного митохондрий богатыхЭксперимент закончен, усыпить рыбку, поместив его на водяной бане при передозировке бензокаин. Используйте тупые щипцы, чтобы поднять крышечку на одной стороне головы и изогнутые ножницы, чтобы отрезать каждый конец корзине жаберных жаберных. Тщательно подобрать жабры от тычинки с использованием тупых щипцы и поднимите их из оперкулярной полости. Немедленно промыть жабры в ледяной 1x PBS, чтобы удалить избыток бензокаин и кровь. Поместите вырезали жабры в отдельных ампулах (флакон для каждого жаберной дуги), заполненной 4% PFA и исправить O / N при 4 ° С. После фиксации стирать избыток PFA в 1X PBS, и поместить ткани в 2 мл пули трубки, заполненной 1,5 мл 1% Triton-X на шейкере в течение 6 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С. Этот шаг permeabilizes ткани. Если вся жаберных слишком большой, чтобы поместить в 2 мл пробирку затем разрезать ткань на части, достаточно маленькие, чтобы соответствовать трубки, стараясь не повредить нити. Подготовка первичных антител разведения Мисин 4 мкл исходного раствора каждого первичного антитела (всего 8 мкл) в 992 мкл 1х PBS. Убедитесь, что НКА (этикетки НКА богатых клетки) и Zn-12 (этикетки нейроны) первичные антитела были подняты в том же хосте. Это важно, если исследователи решили определить конкретные подтипы IC в то же время, для которых они должны будут использовать первичные и вторичные антитела, которые выросли в разных видов хозяев. Извлеките Тритон-X решение и без промывки ткани добавляют 1 с: 250 разбавление (разбавленной в 1x PBS) моноклонального антитела NKA (α-5) для обнаружения NKA-богатые клеток и нейронов данио конкретного антитела (Zn-12) для обнаружения нервных волокон (первичные антитела) и инкубируют в шейкере в течение 6 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С. Промыть первичного антитела 3 раза по 3 мин каждый из которых использует 1X PBS. Чтобы сделать это, удалите первичный раствор антител от трубки всасывания его с помощью пипетки. Подготовка вторичного антитела в1: 200 разбавление путем смешивания 5 мкл вторичного антитела фондовой в 995 мкл 1х PBS. Применение вторичного антитела (Alexa Fluor 488) и инкубируют в течение 6 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С на качалке. ПРИМЕЧАНИЕ: Mitotracker Красный возбуждается на ~ 594 нм длины волны, и высветится красным цветом. Вторичное антитело, которое возбуждается на ~ 488 нм длины волны, и флуоресцирует зеленый должны быть использованы для обозначения NKA и Zn-12 первичных антител. Удалить избыток вторичного антитела путем промывки ткани 3 раза в течение 5 мин каждый (как описано в стадии 3,7). 4. изображений После промывки, установите ткани на вогнутой слайд для всей установки конфокальной микроскопии клеток и нервных волокон. Для установки ткани, в первую поместите его в папку (200 мкл) 1x PBS на плоской предметное стекло. Это гарантирует, что ткань не пересушивает. Отдельные жаберные hemibranchs с изогнутыми микро-ножниц. Поместите каплю 1x PBS и снижение монтажных СМИ в вогнутой слайд, Поместите разделенных hemibranchs в вогнутую слайд с передней кромки нити вверх и накрыть покровным стеклом. Приложите края покровного стекла с лаком для ногтей в целях предотвращения покровное передвигаться и перемещения ткани. Разрешить ткани оседают на дно вогнутой слайд в течение 10 – 15 мин до визуализации. Для каждого жаберной дуги, выбрать один из шести жаберных нитей наугад для работы с изображениями, создавая шесть изображений в жаберной дуги. Используйте обычный конфокальной микроскопии для изображения тканей, взяв 1 – 3 мкм оптических срезов. Примечание: Любые уже существующие ячейки будут помечены Mitotracker красный и позитивным для НКА появится только желтого цвета. Клетки, которые появляются красные только уже существовали ИС, которые не содержат НКА. Любой вновь распространились клеток будет только положительным для НКА и появится только зеленый. Нервные волокна также появится зеленый. 5. Анализ изображений для Ionocyte количественной Для ВАСч жаберных нитей, которые были отображены, количественно ИС и связанных с ними иннервации путем прокрутки разделов Z стека и подсчета количества пластинчатых и filamental ИС настоящее и действительно ли они являются вновь дифференцируются, уже существующие и / или Иннервируются , Количественную оценку ИС на нить или на область (мм 2) нити. Сделайте это с помощью инструментов рисования, связанные с программным обеспечением, используемым на приобретение изображения очертить пластинки нити охватывающей область нити, в которых количественно ИС. Большинство компьютерных программ конфокальной микроскопии есть возможность рассчитать площадь контурным области на изображении. Используйте эту опцию в ПО для обработки изображений, которая позволяет это сделать, чтобы получить этот район. Разделить подсчитанные ИС в области, рассчитанной с помощью программного обеспечения, чтобы получить меру ИС на единицу площади (например, на 2 мм).