魚にIonocytesを研究するために完全な二国間ギル脱神経と相まって時差染色技術

両方のプロトコルは動物ケアのカナダ人評議会（CCAC）のガイドラインに準拠し、大学オタワの動物管理委員会（プロトコルBL-226）の承認を得て実施した。 1.時差染色技術：ミトコンドリアが豊富な染料バースジメチルスルホキシド（100％DMSO）の94.0μlの50μgのを溶解して1 mMののMitoTrackerレッド原液を準備します。使用しないときは-20℃で暗所に原液を保管してください。凍結/解凍サイクルを避けてください。 600ミリリットルの最大容量で – （6箱3）暗黒の箱を準備します。システムの水400ミリリットル（水通常に保持されている魚）でボックスを記入し、O 2の供給源を提供するために、各ボックス内の空気の石を配置。金魚を入手（30〜40グラム）を400 mlの水と空気の石のボックスに配置します。 30分後、0.1μMおよび0.01％DMSOの最終濃度を得るために実行可能なミトコンドリアが豊富な染料を追加します。 4時間魚を浸すR。 これらのコントロールの魚（ すなわち、無脱神経）である場合、ボックスへの水の流れをオン染料洗い流しプロトコルに割り当てられた時間の期間、魚を回復することを可能にする。 5日 – 魚は典型的には3のために回収される。 時差染色技術：免疫組織化学の回復期間の後、 第3節に進んでください。これらの魚は、除神経される場合は、セクション2に進んでください： 完全な二国間除神経手順 。 2.完全な二国間除神経手順学生Vannasスプリングはさみ（曲線）、標準パターン鉗子曲面の標準パターン鉗子ストレート、1組の1組、第5鉗子、組織リトラクターの1ペア、小さなコットンボール（1の2組の1組を取得 – 直径2 mm）であり、綿棒（Qヒントまたは同等）。 麻酔薬水浴を準備します。まず、最終容量100mlにベンゾカイン10gを溶解させるストック溶液を調製し、99％のエタノール。麻酔水浴を調製するために、必要な温度で曝気システム水30リットル中にストックベンゾカイン溶液15mlに溶解する。水槽に空気ポンプまたは中央エアラインに接続されたエアストーンを配置することによって、水を通気する。 麻酔薬水浴（ 図1A）に魚を置きます。 呼吸が停止した後、手術台上の魚を配置し、 図1Bに示すように、挿管。曝気麻酔液と鰓を灌漑するために、その口腔内チューブを挿入することによってこれを行います。えらの灌漑は、魚が除神経処置中にO 2及び麻酔薬の十分な量が供給されることを保証する。頭が少し下向きに傾斜されるように魚を置きます。これは、第四鰓弓の背後にあるエリアへのより良いアクセスを可能にします。 優しくストレート標準パターン鉗子で蓋を持ち上げるそして蓋と頭部の内側との間の組織のリトラクターを配置。慎重に頭から蓋を維持し、露出した鰓を維持するために、組織のリトラクターを開きます。 麻酔液はこの手順の間鰓を灌漑していることを確認してください。リトラクターは、すべての4つの鰓のアーチへのアクセスを提供する頭の横のハンドルを置きます。 頭部への第四の鰓弓を装着する靭帯の張力を作成するためにそれらを開く優しく四鰓弓と後頭部の間に湾曲した標準パターン鉗子を置き、。主鰓蓋空洞に鰓弓の背側の端を接続する上皮を貫通することにより、 – （3 mm 2）と第5ピンセットで小さな開口部を作成します。主要な血管を損傷する危険性があるので、あまりにも深くに行くしないように注意してください。 第5鉗子で開催され、小さなコットンボールでゆっくりと慎重にIX（舌咽）とX（迷走）神経を露出するように切開を展開します。フリー再び血管を傷つけないように注意しながら、5号鉗子を使用して、すべての結合組織から神経。 注：金魚の鰓IXおよびX神経は第四の鰓弓の後ろに深い休息と鰓のアーチへの供給の主要な血管に近接している。 神経一度湾曲した標準形状鉗子とのオープン切開を保持した状態で湾曲した春のはさみは慎重に神経を切断するために使用することを確認されている。神経を切断した後、緩やかに湾曲鉗子を撤回。 48時間 – 上皮は非常に薄く、切開は、通常24内にそれ自身で閉じているため縫合糸で切開を閉じる必要はない。組織リトラクターを削除します。 頭の反対側に同じ手順を繰り返します。 麻酔から魚を回収するために新鮮な曝気水に麻酔から鰓の灌漑を切り替えます。一度主鰓蓋の動きは、少なくとも24時間、静養するために実験的なタンクに魚を移動し再開した。 <li>は魚の別のセットの「偽」の手順を実行します。 「偽」の手順では、神経を切断することなく、第四の鰓弓の背後にある上皮を貫通することを含む。 3.時差染色技術：免疫組織化学まず、1×リン酸緩衝生理食塩水（; PBS 96mlの中に4グラムPFA PBS）中の4％パラホルムアルデヒド（PFA）を調製する。 PFAは室温でPBS中に簡単に溶解しない。 PFAを溶解し、水浴中で熱溶液。ヒュームフードでこれを実行します。 PFAは、溶液中になったら、使用前に冷ます。 2週間まで4℃で保管してください。 8シンチレーションバイアル（鰓弓あたり1バイアル）の合計のためのシンチレーションバイアルに4％PFAの4ミリリットル – 魚を安楽死と鰓組織を抽出する前に、3を配置。また、小さな量るボートに乗り、1×PBSでそれを埋める。これは、切除された後に組織を洗浄するために使用される。氷の上にすべてのソリューションを保管してください。 実行可​​能なミトコンドリアが豊富な色素露光の後実験は、ベンゾカインの過剰摂取で水浴に置くことで金魚を安楽死させる、終了した。 鰓鰓バスケットのそれぞれの端を切断する頭部の片側の蓋や湾曲したハサミを持ち上げるために鈍鉗子を使用してください。慎重に鈍ピンセットを用いて耙によって鰓をピックアップし、主鰓蓋空洞からそれらを持ち上げる。すぐに過剰ベンゾカインと血液を除去するためにPBS 1Xの氷冷で鰓を洗う。 4％PFAで満たされた別々のバイアルで切除した鰓（各鰓弓用バイアル）を配置し、4℃でO / Nを修正。 固定後、1×PBSで過剰PFAを洗浄し、4℃でRTまたはO / Nで6時間、シェーカー上、1％のTriton-Xの1.5ミリリットルで満たされた2ミリリットルの弾丸チューブに組織を置く。このステップでは、組織を透過性に。全体ギルは2ミリリットルチューブに置くには大きすぎる場合には、フィラメントに損傷を与えないように注意しながらチューブを収まるほど小さいのセクションに組織を切断。 MIによる一次抗体希釈液を調製するXINGの1X PBS 992μLに各一次抗体（8μLの合計）のストック溶液4μlの。 NKAは（NKAが豊富な細胞を標識する）ことを確認し、ZN-12（ラベルニューロン）一次抗体が同じホストに提起されている。研究者は、彼らが別の宿主種で育った一次および二次抗体を使用する必要がありますいると同時に、特定のICのサブタイプを識別することにした場合、これは重要です。 トリトンX溶液を除去し、組織を洗浄せずに1追加：NKAが豊富な細胞を検出するためにNKAモノクローナル抗体の250希釈（1×PBS中に希釈する）（α-5）とゼブラフィッシュ特定の神経抗体（ZN-12）神経線維（一次抗体）を検出し、4℃でRTまたはO / Nで6時間、シェーカー上でインキュベートする。 1X PBSを用いて3分間ずつ、一次抗体を3回洗浄する。これを行うには、ピペットを用いて、それを吸引することにより、チューブから一次抗体溶液を除去。 二次抗体を準備1：1×PBSの995μLに株式の二次抗体の5μLを混合することによって200希釈。二次抗体（アレクサフルオロ488）を適用し、シェーカー上、4℃でRTまたはO / Nで6時間インキュベート。 注：のMitoTrackerレッドは、〜594 nmの波長で励起され、赤の蛍光を発する。 〜488nmの波長で励起され、緑色の蛍光を発する二次抗体は、NKAにラベルを付け、ZN-12一次抗体を使用する必要があります。 （ステップ3.7で説明したように）5分ごとに組織を3回洗浄することにより、過剰な二次抗体を除去します。 4.イメージング洗浄後、細胞全体および神経線維の共焦点イメージングをマウントするための凹状のスライド上の組織をマウントします。組織をマウントするには、第1平坦顕微鏡スライド上に1×PBSの滴（200μL）に入れてください。これは、組織が乾燥することはありません。 湾曲したマイクロハサミで鰓hemibranchs区切ります。 1×PBSのドロップと凹スライドに取り付けメディアのドロップを置きます。 上に向けフィラメントの先端に凹面スライドに分けhemibranchsを置き、カバーガラスでカバーしています。動き回ると、組織を変位からカバースリップを防止するためにマニキュアを有するカバースリップの端を軽く。イメージングの前に15分 – 組織が10のために凹面スライドの底に沈殿することを許可する。 各鰓弓の場合は、鰓弓あたり6枚の画像を生成する、画像化のためにランダムに6鰓フィラメントを選択します。 3μmの光学スライス – 1を取ることによって、イメージに組織を従来の共焦点顕微鏡を使用してください。 注：すべての既存の細胞がNKAのためのMitoTracker赤とポジティブで標識されるだけ黄色に表示されます。赤い表示された細胞は、唯一のNKAが含まれていない既存のICです。でも新たに増殖した細胞のみがNKAのためにポジティブになり、唯一の緑が表示されます。神経繊維も緑色に表示されます。 Ionocyte定量5.画像解析 EACのために撮影された時間鰓フィラメントは、Zスタックのセクションをスクロールし、存在し、それらが新たに分化しているか否かを、既存の、および/または神経支配ラメラ及びフィラメント状ICの数をカウントすることによりICと関連する神経支配を定量。 フィラメントの（mm 2）とフィラメント当たりや面積あたりのICを定量化する。 ICが定量化されたフィラメントの領域を網羅するフィラメントのラメラを概説するために画像を取得するために使用されるソフトウェアに関連した描画ツールを使用することによってこれを行います。ほとんどの共焦点イメージングソフトウェア·プログラムは、画像上で概説した領域の面積を計算するためのオプションを持っている。あなたが領域を取得するためにこれを行うことを可能にするイメージングソフトウェアのオプションを使用します。 単位面積（ 例えば、1mm 2あたり）あたりのICの測定値を得るために、ソフトウェアによって計算領域によってカウントICを分割する。