טכניקת זמן דיפרנציאלי מכתים יחד עם גיל דו-צדדי מלא denervation ללמוד Ionocytes בדגים
Summary
This manuscript describes a protocol to track the re-distribution of branchial ionocytes and their innervation using a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation.
Abstract
ionocytes branchial (ICs) הם היחידות פונקציונליות לרגולציה יונית בדגים. אצל מבוגרים, הם נמצאים בfilamental וepithelia שבשבת של הזימים שבו הם יוני תחבורה כגון Na +, Cl – וCa 2 + באמצעות מגוון רחב של תעלות יונים, משאבות ומחליפות. הזימים החוליות הוא innervated extrinsically על ידי, לשון או לוע (IX) ותועים עצבים (X) פנים (VI). עצבי IX ו- X הם גם המקור החיצוני של עצבוב IC branchial. הנה, שתי טכניקות משמשות ללמוד עצבוב, התפשטות והפצה של מעגלים משולבים מתוארות: טכניקת צביעת ההפרש זמן וטכניקת denervation זימים דו-צדדית מלאה. בקצרה, דג זהב חשוף לצבע mitochondrion הספציפי חיוני (למשל, MitoTracker אדום) אשר תוויות (הקרינה אדומה) שבבים קיימים מראש. דגים הורשו גם להתאושש במשך 3-5 ימים או עברו denervation זימים דו-צדדי מלא באופן מיידי. לאחר 3-5 ימים של התאוששות, gחוליים נקצרים וקבועים אימונוהיסטוכימיה. הרקמה אז מוכתם בα-5 נוגדן ראשוני (יעדים Na + / K + ATPase המכיל תאים) בשיתוף עם נוגדנים משני שמתייג את כל (שניהם קיימים מראש החדש ו) הירוקים השבבים. השימוש בהדמית confocal, שהוכיח כי שבבים קיימים מראש מופיעים צהובים (שכותרתו עם שני לצבוע mitochondrion ספציפי קיימא וα-5) ושבבים חדשים מופיעים ירוק (שכותרתו עם α-5 בלבד). יכולות להיות מיושמות גם טכניקות המשמשות במקביל ללימודי עצבוב, הפצה והפצה של מעגלים משולבים בנימת הזימים דגים כאשר נחשפים לאתגרים סביבתיים.
Introduction
מעגלים משולבים הם היחידה הפונקציונלית לרגולציה יונית בדגים ובנמצאים על משטחי אפיתל של חוטי הזימים וlamellae 4,6-8,10. למרות מגוון רחב של תת תוארו שיש תכונות ייחודיות, רב של השבבים מאופיינים בצפיפות גבוהה של מיטוכונדריה (ובכך הם ידועים גם בשם תאי mitochondrion העשיר) ו / או שפע של האנזים Na + / K + ATPase (NKA). בדרך כלל, בית שבבים אלה מגוון של משאבות אחרות, תעלות יונים ומחליפים מעורבות בויסות יון (למשל, Na + / H + מחליף, Na + / Cl – שיתוף טרנספורטר, H + משאבה) 2,10,11. חלוקה מחדש ושגשוגם של מעגלים משולבים כמנגנון פיצוי הוא מרכזיים לשמירה על הומאוסטזיס יון במיוחד בלחץ יוני (לדוגמא, חשיפה למים יון-עני) 4,8,9.
מחקר זה מתאר techni צביעת ההפרש זמןque 1 לזהות ionocytes התרבו לאחרונה (ICs) בזימי דגים. טכניקה זו בשילוב עם denervation דו-צדדי מוחלט של קשתות זימים. דג זהב (Carassius auratus), המינים המשמשים במחקרים אלה, הוא גם מתאים ללמוד התפשטות של תאי אפיתל זימים כי יש להם יכולת מופלאה לשפץ מבני הזימים 2. שיפוץ גיל מתייחס לצמיחה או ההכחשה של מסת תאי interlamellar (ILCM) כאשר הדגים (בדרך כלל נשמרים ב15-30 מעלות צלזיוס) הם הסתגלו למים קרים (<15 ° C) או היפוקסיה, בהתאמה 3. מחקרים קודמים תוך שימוש בטכניקת צביעת ההפרש הזמן על דג זהב התמקדו בחלוקה מחדש, העצבוב ושגשוגם של מעגלים משולבים בזימים בהקשר של זימים שיפוץ 4,5. transfe קאטו ו1 Kaneko פיתחו שיטה חדשנית זו כדי לחקור את השינוי והחלפה של שבבי branchial בנאוויות (Fundulus heteroclitus)rred מים מן הים (SW) למים מתוקים (FW). במחקר זה, הדגש הוא על ההתפשטות והעצבוב של שבבים בדג הזהב התאקלמו עד 25 ° C.
שימוש בטכניקת צביעת ההפרש הזמן זה היה מראה כי, בהקשר של שיפוץ זימים, דג זהב לשמור על מספר קבוע של שבבים במהלך חשיפת חוסר חמצן והתאוששות normoxic שלאחר מכן, עם זאת, אחוז תאי innervated ירד במהלך תקופת התאוששות normoxic 5. הוצע לפני יותר מ -70 שנים שמנגנוני קליטה יוניות בדגים נמצאים בשליטה עצבית 12. הזימים החוליות הוא innervated על ידי עצבי פנים (VII), לשון או לוע (IX) ותועה (X) המכונים גם "עצבי branchial" 13,14. מחקרים על ידי Jonz ואחות (2003) בדג הזברה (Danio rerio) עצבוב זימים הראו כי מקורו של העצבוב הוא חיצוני (גוף תא של סיבי עצב הוא חיצוני לזימים), כמו גם פנימי (גוף תא שלסיבי עצב הוא מהותיים לזימים). אותם החוקרים הראו גם כי שבבי branchial מעוצבבים 7 extrinsically.
במחקר זה, טכניקת צביעת ההפרש הזמן בשילוב עם denervation זימים דו-צדדי מלא הייתה בשימוש כדי לחקור את ההתפשטות של שבבים חסרי עצבוב חיצוני בדג זהב. denervation זימים דו-צדדי מלא מתייחס לניתוק IX עצבי גולגולת וX. שתי גישות אלה הן אפשריים בדג זהב בגלל הגודל שלהם גדול יחסית (30-200 ז) מפשט את ההליכים כירורגיים העדינים, וionocytes קלות מזוהות באמצעות טכניקות חיסוני histochemical סטנדרטיים. במחקר הנוכחי, שבבים היו דמיינו באמצעות צבע חיוני mitochondrion הספציפי (למשל, MitoTracker אדום) או נוגדן ראשוני נגד α-המקטע של Na + / K + -ATPase (α-5; התפתחותית מחקרי Hybridoma הבנק, אוניברסיטה איווה, Iowa City IA). פרוטוקול זה מספק metho פשוטד של הדמיה וניתוח חלוקה מחדש ושגשוגם של מעגלים משולבים בזימי הדגים.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכניקת צביעת ההפרש הזמן יכולה להיות כלי שימושי כדי להבין את הרגולציה הדינמית של ספיגת יון ולבחון חלוקה מחדש הזמנית של מעגלים משולבים בepithelia הזימים. למרות שהליך פשוט, יש מספר נקודות מפתח שהם חיוניים להצלחה של טכניקת צביעת ההפרש הזמן. דג הזהב צריך להיות חשוף לצבע mitochondrion העשיר לזמן המוקצב בפרוטוקול. חשיפות קצרות יותר יגרמו לספיגה ירודה של הצבע על ידי תאי mitochondrion עשיר (כלומר, ionocytes). במהלך קיבעון, רקמת הזימים יש להוציא במהירות והמשיכה בחושך כדי למנוע הלבנת תמונה. הרקמה חייבת להיות מעובד להדמיה בתוך 2 שבועות של קיבעון. במהלך הליך חתך עצב דו-צדדי להבטיח כי הדגים הוא גם מורדמים; העצבים וכלי דם מזוהים בבירור; והדגים יתחדש פונקצית opercular מלאה לפני שהוא עבר לטנק התאוששות.
"> סביבת FW מציגה דגים עם האתגר הכפול של איזון הפסדי יון פסיביים ורווח מים האוסמוטי 14. איזון הפסדי יון פסיביים מתרחש באמצעות הספיגה הפעילה של מלח על פני המעגלים המשולבים המקומיים לfilamental וepithelia שבשבת שבו הם יכולים ליצור קשר ישיר עם הסביבה החיצונית 2,4,8,9,16. עם זאת, המיקום של המעגלים המשולבים בזימים אינו סטטי. בשלושת העשורים האחרונים מספר מחקרים הראו כי מספר מיני דגי FW, כאשר הוא מתמודד עם אתגר יוני ו / או טמפרטורה, להפיץ מחדש שבבי branchial מחוט הלהט או הבסיס של lamella לאזורי דיסטלי יותר של lamella 1,2,4,5,17-21. חלוקה מחדש כזה עשוי להגדיל את העובי של lamellae ש יכול להתפשר העברת גז (O 2, CO 2) על פני epithelia הזימים 22. חוקרים השתמשו בטכניקת צביעת ההפרש הזמן המתוארת בכתב היד הזה כדי לעקוב אחר רילוקיישן וemergencדואר של שבבים חדשים על epithelia הזימים בתנאים אלה שונים ניסיוניים (איור 1 ג) 1,4,5.הזימים, ומן הסתם שבבי branchial, מעוצבבים על ידי עצבי גולגולת IX ו- X 7,23-25. עצבים אלה לשאת שני efferent ותשומות מביא ומהזימים, בהתאמה. הם ממוקמים בצד הגב של החלל buccal מאחורי קשת הזימים 4 th. הנגישות של עצבים ואת הקלות שבה ניתן לבצע את הליך denervation הדו-צדדי היא מינים ספציפי. בפורל, למשל, את האנטומיה המחודדת והשטוחה של הראש מאפשרת לעצבים לשכב במישור אחד מאחורי קשת הזימים 4 th מתחת לשכבה דקה של רקמה. זה הופך את העצבים גלויים ונגישים לחוקר לבצע את הליך denervation. בניגוד לכך, יש לי דג זהב חוטם קצר וראש עגול. עצבי גולגולת IX ו- X של דג זהב לשקר עמוקים יותר לתוך si הגבדה של החלל לאחר קשת הזימים 4 th הכובש מישורים שונים. נטייה זו מגבילה את הנגישות לעצבים ודורשת גישה זהירה יותר לזהות ולנתק את העצבים המתאימים. מטרתו של נוהל denervation היא להסיר קלט מביא וefferent חושי ומהזימים, בהתאמה. Denervation של קשתות זימים גם יכול להיות בשילוב עם ניסויי שטף יונים באמצעות רדיואיזוטופים (למשל, 22 Na). טכניקות אלה יכולים לשמש במקביל ללמוד את תרומתם של קלט עצבים על תנועת יונים על פני epithelia הזימים. מגבלה נוספת להליך denervation היא חוסר היכולת להבחין בין נוירונים חושיים ומוטוריים, ובכך, כאשר ניתוק העצב צרור זה אפשרי ששני הסוגים של עצבוב מתבצעים הוסרו. ניתוק כל הנוירונים מוטוריים עשויה להשפיע על הזימים ותנועת opercular של הדגים. כך בעת ביצוע ניסויי denervation זימים חשוב גם כדי לפקח על אוורור לאחרדגים התאוששו מההליך כדי להבטיח שיש תנועת זימים מספיקה לשני גז וחילוף יונים.
הפרוטוקולים שתוארו בבעלי החיים המבוגרים כתב היד הזה שימוש המשיכו אור 00:12: מחזור כהה וכדורי מזון המסחריים fed. ניתן לשנות שיטות אלה בכמה דרכים. ראשית, תקופת ההחלמה לאחר חשיפת צבע mitochondrion העשיר יכולה להיות מותאמת לדרישות של הפרוטוקול של החוקר (לדוגמא, 1, 3, 5, או 14 ימים). התקופה הארוכה ביותר של התאוששות לאחר חשיפת צבע mitochondrion העשיר במעבדה כבר 14 ימים 4,5. לא הייתה ירידה משמעותית בעוצמת הקרינה של הצבע mitochondrion העשיר אחרי 14 ימים של התאוששות. שנית, השימוש בα-5 הנוגדן הראשוני מוגבל לזיהוי רק תאי NKA העשיר ואינו מבחינים בין תת-הסוגים השונים של שבבי branchial. למרבה המזל, בדג זהב נקבע כי רוב השבבים שניהם mitochondrיון-עשיר (תווית עם MitoTracker) וNKA עשיר (תווית עם α-5) תאים אשר לא יכול להיות מקרה בכל מיני הדגים 4,27. ניסויים עתידיים יכולים להתמקד בבעקבות חלוקה מחדש הזמנית של תת IC הספציפי באמצעות נוגדנים מכוונים במיוחד נגד מגוון רחב של ערוצים, משאבות ומחליפות (לדוגמא, nhe, H + משאבה). מחקרים קודמים מצאו כי הרוב המכריע של ionocytes מוכתם בתערוכת צבע mitochondrion העשיר immunoreactivity NKA 4. עצבוב של המעגלים המשולבים יכול להיות מזוהה על ידי שימוש בנוגדן ראשוני נגד אנטיגן נגזר דג הזברה נוירון הספציפי (Zn-12). במחקר זה, α-5 ו- Zn 12 נוגדנים ראשוניים התגלו על ידי שימוש באותו נוגדנים משני (Alexa פלואוריד 488) לשניהם. הגבלה זו נובעת משני הנוגדנים העיקריים שהועלו במארח עכבר ולהתגבר על ידי העובדה שתאי NKA עשיר ונוירונים ניתן להבחין מורפולוגית למרות שהם לזרוח באותו צבע. צביעה רציפהעם נוגדנים שונים משני (למשל, α-5 הראשון עם אלקסה פלואוריד 488 אז Zn-12 עם אלקסה פלואוריד 594) יכול לשמש גם כדי למנוע את הבעיה של שיש שני סמני fluorescing באותו הצבע. לבסוף, פרוטוקול חתך עצב דו-צדדי המלא יכול להיות שונה כדי למקד את העצבים לקשתות זימים ספציפיים. לדוגמא, חתך עצב סלקטיבית יכול להתבצע על קשת הזימים הראשונה בעדינות על ידי הפרדת קשתות הזימים הראשונות ושנייה כדי לחשוף את העצבים שמוביל לקשת הזימים הראשונה בסוף הגב של סל הזימים (איור 2 ב-E). טכניקת ההפרש הזמן יכולה להיות מיושמת גם כדי ללמוד את חלוקת ionocytes בדגי דג הזברה זחל כפי שהם מפתחים ומעברי תחבורת יון מהעור לזימים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank William Fletcher for animal care at the University of Ottawa. The authors would also like to thank Dr. William Milsom for teaching VT the full bilateral denervation technique at the University of British Columbia. A travel grant for this research was provided by the Faculty of Graduate and Postgraduate Studies at the University of Ottawa. This research is also supported by NSERC PGS-D scholarship to VT and Discovery Grants Program to SFP.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| MitoTracker Red | Life Technologies | M-7512 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Alrdich | D2650 | |
| α-5 primary antibody | Develompental Hybridoma Bank | a5 | |
| zn12 primary antibody | Develompental Hybridoma Bank | zn12 | |
| Alexa Fluor 488 (anti mouse) | Life Technologies | A-11001 | |
| Benzocaine | Sigma Alrdich | E1501 | 4-Aminobenzoic acid ethyl ester, Ethyl 4-aminobenzoate |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | straight |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | curved |
| Dumont No. 5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Tissue retractor | Fine Science Tools | 17009-07 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Alrdich | P6148 | |
| Triton X | Sigma Alrdich | X100 | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Katoh, F., Kaneko, T. Short-term transformation and long-term replacement of branchial chloride cells in killifish transferred from seawater to freshwater, revealed by morphofunctional observations and a newly established ‘time-differential double fluorescent staining’ technique. J. Exp. Biol. 206 (22), 4113-4123 (2003).
- Perry, S. F. Relationships between branchial chloride cells and gas transfer in freshwater fish. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 119 (1), 9-16 (1998).
- Sollid, J., Weber, R. E., Nilsson, G. E. Temperature alters the respiratory surface area of crucian carp Carassius carassius and goldfish Carassius auratus. J. Exp. Biol. 208 (6), 1109-1116 (2005).
- Mitrovic, D., Perry, S. F. The effects of thermally induced gill remodeling on ionocyte distribution and branchial chloride fluxes in goldfish (Carassius auratus). J. Exp. Biol. 212 (6), 843-852 (2009).
- Tzaneva, V., Vadeboncoeur, C., Ting, J., Perry, S. F. Effects of hypoxia-induced gill remodelling on the innervation and distribution of ionocytes in the gill of goldfish, Carassius auratus. J. Comp. Neurol. 522 (1), 118-130 (2014).
- Greco, A. M., Fenwick, J. C., Perry, S. F. The effects of soft-water acclimation on gill structure in the rainbow trout Oncorhynchus mykiss. Cell Tissue Res. 285 (1), 75-82 (1996).
- Jonz, M. G., Nurse, C. A. Epithelial mitochondria-rich cells and associated innervation in adult and developing zebrafish. J. Comp. Neurol. 497 (5), 817-832 (2006).
- Laurent, P., Hebibi, N. Gill morphometry and fish osmoregulation. Can. J. Zool. 67 (12), 3055-3063 (1989).
- Perry, S. F., Laurent, P. Adaptational responses of rainbow trout to lowered external NaCL concentration: contribution of the branchial chloride cell. J. Exp. Biol. 147, 147-168 (1989).
- Evans, D. H., Piermarini, P. M., Choe, K. P. The multifunctional fish gill: dominant site of gas exchange, osmoregulation, acid-base regulation, and excretion of nitrogenous waste. Physiol. Rev. 85 (1), 97-177 (2005).
- Hwang, P. P., Lee, T. H., Lin, L. Y. Ion regulation in fish gills: recent progress in the cellular and molecular mechanisms. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 301 (1), R28-R47 (2011).
- Krogh, A. The Active Uptake of Ions into Cells and Organisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 25 (6), 275-277 (1939).
- Nilsson, G. E., Randall, D. J., Hoar, W. S. Innervation and pharmacology of the gills. Fish Physiology. , 185-272 (1984).
- Sundin, L., Nilsson, S. Branchial innervation. J. Exp. Zool. 293 (3), 232-248 (2002).
- Dymowska, A. K., Hwang, P. P., Goss, G. G. Structure and function of ionocytes in the freshwater fish gill). Respir. Physiol. Neurobiol. 184 (3), 282-292 (2012).
- Witters, H., Berckmans, P., Vangenechten, C. Immunolocalization of Na+/K+-ATPase in the gill epithelium of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Cell Tissue Res. 283 (3), 461-468 (1996).
- Bindon, S., Fenwick, J. C., Perry, S. F. Branchial chloride cell proliferation in the rainbow trout, Onchorhynchus mykiss: implications for gas transfer. Can. J. Zool. 72 (8), 1395-1402 (1994).
- Bradshaw, J. C., Kumai, Y., Perry, S. F. The effects of gill remodeling on transepithelial sodium fluxes and the distribution of presumptive sodium-transporting ionocytes in goldfish (Carassius auratus). J. Comp. Physiol. B. 182 (3), 351-366 (2012).
- Chou, M. Y., et al. Effects of hypothermia on gene expression in zebrafish gills: upregulation in differentiation and function of ionocytes as compensatory responses. J. Exp. Biol. 211 (19), 3077-3084 (2008).
- Kaneko, T., Katoh, F. Functional morphology of chloride cells in killifish Fundulus heteroclitus, a euryhaline teleost with seawater preference. Fisheries Science. 70 (5), 723-733 (2004).
- Ouattara, N., et al. Changes in gill ionocyte morphology and function following transfer from fresh to hypersaline waters in the tilapia Sarotherodon melanotheron. Aquaculture. 290 (1-2), 155-164 (2009).
- Bindon, S., Gilmour, K., Fenwick, J., Perry, S. The effects of branchial chloride cell proliferation on respiratory function in the rainbow trout, Oncorhynchusmykiss. J. Exp. Biol. 197 (1), 47-63 (1994).
- Dunel-Erb, S., Bailly, Y., Laurent, P. Pattern of gill innervation in two teleosts, the perch and the trout. Can. J. Zool. 71, 18-25 (1993).
- Jonz, M. G., Nurse, C. A. New developments on gill innervation: insights from a model vertebrate. J. Exp. Biol. 211 (15), 2371-2378 (2008).
- Jonz, M. G., Zaccone, G. Nervous control of the gills. Acta Histochem. 111 (3), 207-216 (2009).
- Milsom, W. K., Reid, S. G., Rantin, F. T., Sundin, L. Extrabranchial chemoreceptors involved in respiratory reflexes in the neotropical fish, Colossoma macropomum (the tambaqui). J. Exp. Biol. 205 (12), 1765-1774 (2002).
- Hwang, P., Lee, T. New insights into fish ion regulation and mitochondrion-rich cells. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 148 (3), 479-497 (2007).
