This manuscript describes a protocol to track the re-distribution of branchial ionocytes and their innervation using a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation.
Kiemen ionocytes (ICs) sind die Funktionseinheiten zur Ionenregulierung in Fisch. Bei Erwachsenen sind, werden sie auf dem filamentösen und Lamellen Epithelien der Kiemen gefunden, wo sie Transport Ionen wie Na +, Cl – und Ca 2+ über eine Vielzahl von Ionenkanälen, Pumpen und Wärmetauscher. Die Knochenfische Kiemen ist extrinsisch durch die Gesichts (VI), glossopharyngeus (IX) und vagus (X) innerviert. Die IX und X Nerven sind auch die äußeren Quelle von Kiemen IC Innervation. Hierbei werden zwei Techniken verwendet, um die Innervation, Proliferation und Verbreitung von ICs studieren beschrieben: ein Zeitdifferenzialfärbungsverfahren und ein voller bilateralen Kiemen Denervierung Technik. Kurz gesagt, werden Goldfisch in eine lebenswichtige Mitochondrien-spezifischen Farbstoff ausgesetzt (zB MitoTracker Rot), die Etiketten (rote Fluoreszenz) vorbestehende ICs. Die Fische wurden entweder läßt 3 erholen – 5 Tagen oder sofort unterzog sich einer vollständigen bilateralen Kiemen Denervierung. Nach 3 – 5 Tage der Erholung, die gKrankheiten werden geerntet und für die Immunhistochemie fixiert. Das Gewebe wird dann mit einem α-5 primären Antikörper gefärbt (Targets Na + / K + ATPase enthaltende Zellen) in Verbindung mit einem sekundären Antikörper, der alle (sowohl neue als auch bereits vorhandene) ICs grün markiert. Mit konfokaler Bildgebung, wurde gezeigt, dass bereits bestehende ICs erscheinen gelb und neuen ICs (sowohl mit einem lebensfähigen Mitochondrium spezifischen Farbstoff und α-5 bezeichnet) erscheinen grün (mit α-5 nur beschriftet). Beide Techniken im Tandem verwendet werden, können angewendet werden, um die Innervation, Proliferation und Verbreitung von ICs auf dem Kiemen Filament zu studieren, wenn der Fisch an Umweltproblemen ausgesetzt.
ICs sind die Funktionseinheit für ionische Regelung auf Fisch und basieren auf den epithelialen Oberflächen der Kiemenblättchen gefunden und Lamellen 4,6-8,10. Obwohl eine Vielfalt von Subtypen beschrieben, die einzigartige Eigenschaften besitzen, sind viele der ICs durch eine hohe Dichte der Mitochondrien (wodurch sie auch als Mitochondrien-reichen Zellen bekannt) und / oder einer Häufigkeit des Enzyms dadurch Na + / K + ATPase (NKA). Typischerweise sind diese ICs Haus eine Vielzahl von anderen Pumpen, Ionenkanäle und Ionenaustauscher Regulierung (zB Na + / H + Austauscher, Na + / Cl – -Co-Transporters, H + Pumpe) beteiligt 2,10,11. Die Umverteilung und Proliferation von ICs als Kompensationsmechanismus ist von zentraler Bedeutung für die Aufrechterhaltung Ionenhomöostase insbesondere bei ionischen Stress (zB Exposition gegenüber Ionen schlechte Wasser) 4,8,9.
Diese Studie beschreibt eine Zeitdifferenz Färbung technique 1 neu vermehrt ionocytes (ICs) in Fischkiemen zu identifizieren. Diese Technik wird mit einem vollständigen bilateralen Denervierung der Kiemenbögen verbunden. Goldfisch (Carassius auratus), die in diesen Studien verwendeten Arten ist gut geeignet, um die Proliferation von Kiemen Epithelzellen zu untersuchen, weil sie eine bemerkenswerte Fähigkeit, baulich umgestalten ihre Kiemen 2 haben. Gill Remodeling bezeichnet, um das Wachstum oder die Zurücknahme eines interlamellaren Zellmasse (ILCM), wenn der Fisch (in der Regel bei 15 gehalten – 30 ° C) werden in kaltem Wasser (<15 ° C) oder Hypoxie bzw. 3 akklimatisiert. Frühere Studien unter Verwendung des Zeitdifferenz-Färbetechnik auf Goldfische auf der Umverteilung, Innervation und Proliferation von ICs auf dem Kiemen im Rahmen der Kieme Umbau 4,5 konzentriert. Katoh und Kaneko 1 entwickelte diese neue Technik, die Umwandlung und den Austausch von Kiemen ICs in killifish studieren (Fundulus heteroclitus) transferot-gefrostet aus Meerwasser (SW), um Frischwasser (FW). In dieser Studie, ist der Fokus auf die Proliferation und Innervation des ICs in Goldfische bis 25 ° C akklimatisiert.
Mit der Zeitdifferenz Färbetechnik wurde gezeigt, dass im Rahmen der Kiemen Umbau, Goldfisch eine konstante Anzahl von ICs bei hypoxischen Belichtung und anschließender normoxischen Erholung jedoch der Anteil der innervierten Zellen sank in der gesamten normoxischen Erholungsphase 5. Es wurde vor mehr als 70 Jahren, dass ionische Aufnahmemechanismen in Fische sind unter neuronalen Steuerung 12 vorgeschlagen. Die Knochenfische Kiemen wird durch die Gesichts (VII), glossopharyngeus (IX) und vagus (X) Nerven auch als "Kiemennerven" bezeichnet 13,14 innerviert. Studien Jonz und Nurse (2003) auf Zebrafisch (Danio rerio) Kiemen Innervation zeigte, dass der Ursprung der Innervation extrinsischen (Zellkörper der Nervenfaser extrinsischen zur Kiemen) sowie inneren (ZellkörperNervenfaser ist untrennbar mit dem Kiemen). Die gleichen Autoren zeigten auch, dass Kiemen ICs extrinsisch innerviert 7.
In dieser Studie wurde die Zeitdifferenz Färbetechnik gekoppelt mit voller bilateralen Kiemen Denervierung verwendet werden, um die Verbreitung von ICs fehlt extrinsische Innervation in Goldfisch zu untersuchen. Voll bilateralen Kiemen Denervierung bezieht sich auf Durchtrennen Hirnnerven IX und X. Diese beiden Ansätze sind denkbar in Goldfisch, weil ihre relativ groß (30 bis 200 g) vereinfacht die empfindlichen chirurgischen Verfahren und ionocytes leicht mit Standard-immunhistochemischen Techniken identifiziert. Developmental Studies Hybridoma Bank University; In der vorliegenden Studie wurden die ICs unter Verwendung eines Vital Mitochondrien-spezifischen Farbstoff (zB MitoTracker Rot) oder einen primären Antikörper gegen die α-Untereinheit der Na + / K + -ATPase (α-5 visualisiert of Iowa, Iowa City IA). Dieses Protokoll bietet eine einfache method der Visualisierung und Analyse der Umverteilung und der Proliferation von ICs auf den Fisch Kiemen.
Der Zeitunterschied Färbetechnik kann ein nützliches Werkzeug, um die dynamische Regelung der Ionenaufnahme zu verstehen und die zeitliche Verteilung der ICs in der Kiemen Epithelien zu untersuchen. Obwohl ein einfaches Verfahren, gibt es eine Anzahl von Kernpunkten, die entscheidend für den Erfolg des Zeitdifferential Färbetechnik sind. Der Goldfisch muss dem Mitochondrium reichen Farbstoff für die Zeit in der Protokoll zugeteilt ausgesetzt werden. Kürzere Expositionen zu einer schlechten Aufnahme des Farbstoffs durch die Mitochondrien-reichen Zellen (dh ionocytes) führen. Während der Befestigung muss der Lamellengewebe schnell herausgeschnitten werden und im Dunkeln gehalten auf ein Foto, Bleich vermeiden. Das Gewebe muss für die Abbildung innerhalb von 2 Wochen Fixierung verarbeitet werden. Während der bilateralen Nervenschneideverfahren zu gewährleisten, dass der Fisch auch narkotisierten; die Nerven und Blutgefäße sind deutlich gekennzeichnet; und die Fische wieder voll Kiemendeckel Funktion, bevor es zu einer Schmutzwassertank bewegt wird.
"> Der FW-Umgebung präsentiert Fisch mit der doppelten Herausforderung von Ausgleichs passive Ionenverluste und Osmosewasser Gewinn 14. Über die aktive Aufnahme von Salz über die ICs, die dem filamentösen und Lamellen Epithelien, wo sie können lokalisiert werden Der Ausgleich der passiven Ionenverluste auftritt in direkten Kontakt mit der äußeren Umgebung 2,4,8,9,16. Jedoch ist die Position der ICs auf dem Kiemen nicht statisch. In den vergangenen drei Jahrzehnten eine Reihe von Studien haben gezeigt, dass mehrere FW Fischart, wenn konfrontiert mit einem ionischen und / oder Temperatur Herausforderung umverteilen Kiemen ICs von dem Faden oder der Basis der Lamelle zu den entfernteren Bereichen des Lamellen 1,2,4,5,17-21. Solche Umverteilung kann die Dicke der Lamellen erhöht die können Gasübertragung beeinträchtigen (O 2, CO 2) über die Kiemen Epithelien 22. Die Forscher haben die in diesem Manuskript beschriebenen Zeitdifferenz Färbetechnik verwendet, um die Verlagerung und EmergenC verfolgenE von neuen ICs auf dem Kiemen Epithelien unter diesen verschiedenen experimentellen Bedingungen (1C) 1,4,5.Die Kiemen und vermutlich die Kiemen ICs, werden von den IX und X Hirnnerven 7,23-25 innerviert. Diese Nerven führen sowohl efferenten und afferenten Inputs zu und von der Kiemen sind. Sie sind an der dorsalen Seite der Mundhöhle hinter dem 4. Kiemenbogen befindet. Die Zugänglichkeit der Nerven und der Leichtigkeit, mit der die bilaterale Denervierung Verfahren kann durchgeführt werden, ist artspezifisch. Forellen, beispielsweise der spitze und abgeflacht Anatomie des Kopfes ermöglicht die Nerven in einer Ebene hinter der 4. Kiemenbogen unter einer dünnen Gewebeschicht liegen. Dies macht die Nerven sichtbar und leicht zugänglich für den Forscher, die Denervierung Verfahren ausführen. Im Gegensatz dazu Goldfische haben eine kürzere Schnauze und einen runderen Kopf. Die IX und X Hirnnerven von Goldfischen liegen tiefer in die dorsale side der Kavität, nachdem die 4. Kiemenbogen Besatzungs verschiedenen Ebenen. Diese Ausrichtung begrenzt die Erleichterung des Zugangs zu den Nerven und benötigt eine sorgfältige Ansatz zur Ermittlung und trennen Sie die entsprechenden Nerven. Ziel des Verfahrens ist es, Denervierung sensorischen afferenten und efferenten eingegeben und von der Kiemen entfernen sind. Denervation der Kiemenbögen kann auch mit Ionenfluß Experimenten unter Verwendung von Radioisotopen (z, 22 Na) gekoppelt werden. Diese Techniken können in Tandem verwendet, um den Beitrag des Nerven Eingang Ionenbewegung durch die Kiemen Epithelien untersuchen. Eine weitere Einschränkung für die Denervierung Verfahren ist die Unfähigkeit, zwischen sensorischen und motorischen Neuronen zu unterscheiden, wodurch bei der Durchtrennen des Nervenbündels ist es möglich, dass beide Arten der Innervation werden entfernt. Trennen Sie alle motorischen Neuronen kann die Kiemen und Kiemendeckel Bewegung der Fische beeinflussen. So beim Ausführen Kiemen Denervierung Experimente ist es wichtig, auch Lüftungs nachdem der MonitorFische aus dem Verfahren zurückgewonnen, um sicherzustellen, daß genügend Kiemen Bewegung mit Gas und Ionenaustausch.
Die in dieser Handschrift Verwendung adulter Tiere beschriebenen Protokolle gehalten auf einem 12:12 Hell: Dunkel-Zyklus und gefüttert kommerziellen Futterpellets. Diese Verfahren können auf verschiedene Weisen modifiziert werden. Erstens kann die Erholungszeit nach Mitochondrium reichen Farbstoff Exposition gegenüber den Anforderungen der Forscher Protokoll (zB 1, 3, 5 oder 14 Tage) eingestellt werden. Die längste Zeit der Erholung nach der Mitochondrien-reichen Farbstoff Exposition im Labor hat 14 Tage 4,5. Es war keine signifikante Abnahme der Intensität der Fluoreszenz der Mitochondrien-reichen Farbstoff nach 14 Tagen der Erholung. Zweitens wird die Verwendung des α-5 primäre Antikörper nur Identifizieren NKA reichen Zellen und nicht zwischen den verschiedenen Subtypen von Kiemen ICs unterscheiden beschränkt. Zum Glück, in Goldfisch wurde festgestellt, dass die Mehrheit der ICs sind beide mitochondrIonen-reich (Etikett mit MitoTracker) und NKA-rich (Etikett mit α-5) Zellen, die nicht in allen Fischarten 4,27 der Fall sein kann. Zukünftigen Experimenten kann nach der zeitlichen Verteilung der spezifischen IC-Subtypen unter Verwendung von Antikörpern, die spezifisch gegen eine Vielzahl von Kanälen, Pumpen und Wärmetauscher (zB NHE, H + Pumpe) gerichtet konzentrieren. Vorherige Studien zeigten, dass die Mehrzahl der ionocytes mit Mitochondrien-reichen Farbstoffausstellungs NKA Immunreaktivität 4 gefärbt. Innervation der ICs können mit einem primären Antikörper gegen Zebrabärbling-abgeleiteten Neuron-spezifische Antigen (zn-12) festgestellt werden. In dieser Studie, α-5 und Zn-12 primären Antikörper wurden unter Verwendung des gleichen sekundären Antikörper (Alexa Fluor 488) sowohl detektiert. Diese Beschränkung ist auf beide primäre Antikörper in einem Mäusewirt erhöht und wird durch die Tatsache, dass die NKA reichen Zellen und Neuronen morphologisch unterschieden werden, obwohl sie die gleiche Farbe fluoreszieren überwinden. Sequential Färbungunterschiedliche Sekundärantikörper (beispielsweise erste α-5 mit Alexa Fluor 488 dann ZN-12 mit Alexa Fluor 594) kann auch verwendet werden, um das Problem, dass die beiden Markierungen fluoreszierende die gleiche Farbe zu beseitigen. Schließlich kann die volle bilateralen Nervenschneide Protokoll modifiziert werden, um Nerven zu bestimmten Kiemenbögen zielen. Beispielsweise können selektive Nerven Schnitte auf der ersten Kiemenbogen durch leichtes Trennen der ersten und zweiten Kiemenbögen, die Nerven, die zu dem ersten Kiemenbogen an der dorsalen Ende der Kiemenkorb (2B-E) ausgesetzt werden durchgeführt werden. Die Zeitdifferenz-Technik kann auch angewendet werden, um die Verteilung der ionocytes Larven Zebrabärbling Fische zu untersuchen, wie sie sich entwickeln und Ionentransportgänge von der Haut an die Kiemen.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank William Fletcher for animal care at the University of Ottawa. The authors would also like to thank Dr. William Milsom for teaching VT the full bilateral denervation technique at the University of British Columbia. A travel grant for this research was provided by the Faculty of Graduate and Postgraduate Studies at the University of Ottawa. This research is also supported by NSERC PGS-D scholarship to VT and Discovery Grants Program to SFP.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MitoTracker Red | Life Technologies | M-7512 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma Alrdich | D2650 | |
α-5 primary antibody | Develompental Hybridoma Bank | a5 | |
zn12 primary antibody | Develompental Hybridoma Bank | zn12 | |
Alexa Fluor 488 (anti mouse) | Life Technologies | A-11001 | |
Benzocaine | Sigma Alrdich | E1501 | 4-Aminobenzoic acid ethyl ester, Ethyl 4-aminobenzoate |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | straight |
Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | curved |
Dumont No. 5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
Tissue retractor | Fine Science Tools | 17009-07 | |
Paraformaldehyde | Sigma Alrdich | P6148 | |
Triton X | Sigma Alrdich | X100 | |
Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |