تقنية وقت التفاضلية تلطيخ جانب كامل الثنائي جيل إزالة التعصيب لدراسة Ionocytes في السمك
Summary
This manuscript describes a protocol to track the re-distribution of branchial ionocytes and their innervation using a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation.
Abstract
ionocytes الخيشومية (ICS) هي الوحدات الوظيفية لتنظيم الأيونية في الأسماك. في البالغين، وجدوا على filamental وظهائر رقائقي من الخيشومية حيث أيونات النقل مثل نا +، الكلورين – والكالسيوم 2+ عبر مجموعة متنوعة من القنوات الأيونية والمضخات والمبادلات. ومعصب على الخيشومية مكتملة العظام خارجيا من قبل الوجه (VI)، اللساني البلعومي (IX) والمبهم (X) الأعصاب. في التاسع والعاشر الأعصاب هي أيضا مصدر خارجي من الخيشومي IC تعصيب. هنا، يتم وصف اثنين من التقنيات المستخدمة لدراسة تعصيب، وانتشار وتوزيع المرحلية: وقت تقنية التفاضلية تلطيخ وتقنية الخيشومية إزالة التعصيب ثنائية كاملة. لفترة وجيزة، ويتعرض ذهبية لصبغة الحبيبات الخيطية محددة الحيوي (على سبيل المثال، MitoTracker الأحمر) التي تصف (مضان أحمر) المرحلية الموجودة مسبقا. سمح الأسماك إما لاسترداد لمدة 3 – 5 ايام أو خضع على الفور كامل الخيشومية إزالة التعصيب الثنائي. بعد 3-5 أيام من التعافي، وزويتم حصاد العلل وثابتة لالمناعية. ثم اتسخت الأنسجة مع الأجسام المضادة الأولية α-5 (الأهداف نا + / K + أتباز تحتوي على خلايا) بالتزامن مع الأجسام المضادة الثانوية التي تصم كل (كل من جديد وموجود مسبقا) المرحلية الأخضر. باستخدام التصوير متحد البؤر، وقد تبين أن المرحلية القائمة من قبل تظهر الصفراء (المسمى مع كل صبغة الحبيبات الخيطية محددة قابلة للحياة وα-5) والمرحلية الجديدة تظهر الخضراء (المسمى مع α-5 فقط). كلا تقنيات تستخدم جنبا إلى جنب يمكن تطبيقها على دراسة تعصيب، وانتشار وتوزيع الشهادات المرحلية على خيوط الخيشومية عندما تتعرض الأسماك للتحديات البيئية.
Introduction
المرحلية هي وحدة وظيفية لتنظيم الأيونية في الأسماك وتوجد على أسطح الظهارية من خيوط الخيشومية وصفاحات 4،6-8،10. وعلى الرغم من مجموعة متنوعة من أنواع فرعية تم وصفها التي تمتلك ميزات فريدة من نوعها، وتتميز العديد من الشهادات المرحلية التي كتبها كثافة عالية من الميتوكوندريا (وبالتالي هي معروفة أيضا على أنها خلايا الحبيبات الخيطية الغنية) و / أو وفرة من انزيم نا + / K + أتباز (NKA). عادة، وهذه المرحلية المنزل مجموعة متنوعة من المضخات الأخرى، القنوات الأيونية والمبادلات المشاركة في تنظيم أيون (على سبيل المثال، نا + / H + مبادل، نا + / CL – شارك في نقل، H + مضخة) 2،10،11. إعادة توزيع وانتشار المرحلية كآلية تعويضية أمر أساسي للحفاظ على التوازن الأيوني خاصة خلال الضغط الأيونية (على سبيل المثال، والتعرض لسوء ايون المياه) 4،8،9.
توضح هذه الدراسة وقت التفاضلي تلطيخ TECHNIكيو 1 لتحديد ionocytes انتشرت حديثا (المرحلية) في خياشيم الأسماك. ويقترن هذا الأسلوب مع إزالة التعصيب الثنائي كاملة من الأقواس الخيشومية. ذهبية (القشري)، والأنواع المستخدمة في هذه الدراسات، هي مناسبة تماما لدراسة تكاثر الخلايا الظهارية الخيشومية لأن لديهم قدرة ملحوظة لإعادة الهيكلية الخياشيم 2. يشير الخيشومية إعادة عرض لنمو أو تراجع من كتلة الخلية بين الصفاحات (ILCM) عندما السمك (حافظ عادة بسرعة 15 – 30 درجة مئوية) وتأقلم على المياه الباردة (<15 ° C) أو نقص الأكسجين، على التوالي 3. وقد ركزت الدراسات السابقة باستخدام تقنية الزمن التفاضلية تلطيخ على ذهبية على إعادة التوزيع، وتعصيب انتشار المرحلية على الخيشومية في سياق الخيشومية إعادة عرض 4،5. Katoh وكانيكو 1 ضعت هذه التقنية الجديدة لدراسة التحول واستبدال المرحلية الخيشومية في أسماك الكيلي فيش (القوعاء heteroclitus) حوالةrred من مياه البحر (SW) على المياه العذبة (FW). في هذه الدراسة، ويتم التركيز على انتشار وتعصيب المرحلية في ذهبية تأقلم إلى 25 ° C.
باستخدام تقنية الزمن التفاضلية تلطيخ أنه قد تبين أنه، في سياق إعادة عرض الخيشومية، ذهبية الحفاظ على عدد ثابت من المرحلية خلال التعرض ميتة والانتعاش normoxic لاحق، ومع ذلك، انخفضت النسبة المئوية للخلايا معصب طوال فترة الانتعاش normoxic 5. واقترح منذ أكثر من 70 عاما أن آليات امتصاص الأيونية في الأسماك هي تحت السيطرة العصبية 12. ومعصب على الخيشومية مكتملة العظام من الوجه (VII)، اللساني البلعومي (IX) والمبهم (X) الأعصاب يشار إليها أيضا باسم "الأعصاب خيشومي" 13،14. الدراسات التي Jonz وممرضة (2003) بشأن الزرد (دانيو rerio) الخيشومية تعصيب أظهر أن أصل تعصيب هو خارجي (خلايا الجسم من الألياف العصبية وخارجي لالخيشومية)، وكذلك جوهري (جسم الخلية منالألياف العصبية هو جوهري لالخيشومية). أظهر نفس الكتاب أيضا أن المرحلية خيشومي ومعصب خارجيا 7.
في هذه الدراسة، تم استخدام تقنية التفاضلية الوقت تلطيخ جانب الكامل الخيشومية إزالة التعصيب الثنائي للتحقيق في انتشار المرحلية التي تفتقر إلى تعصيب خارجي في ذهبية. ويشير كامل الخيشومية إزالة التعصيب الثنائي لقطع الأعصاب القحفية التاسع والعاشر من هذين النهجين مجدية في ذهبية لأن حجمها كبير نسبيا (30-200 ز) يبسط العمليات الجراحية الدقيقة، ويتم تحديد ionocytes بسهولة باستخدام تقنيات المناعية النسيجية القياسية. في هذه الدراسة، تم تصور المرحلية باستخدام صبغة حيوية الحبيبات الخيطية محددة (على سبيل المثال، MitoTracker الأحمر) أو الأجسام المضادة الأولية ضد α-فرعية من نا + / K + -ATPase (α-5؛ دراسات الإنمائية بنك هجين، جامعة أيوا، أيوا سيتي IA). يوفر هذا البروتوكول على metho مباشرد من تصور وتحليل إعادة توزيع وانتشار المرحلية على الخيشومية الأسماك.
Protocol
Representative Results
Discussion
الساعة تقنية التفاضلية تلطيخ يمكن أن تكون أداة مفيدة لفهم التنظيم الديناميكي لامتصاص أيون ودراسة إعادة توزيع الزمني للالمرحلية في ظهائر الخيشومية. وعلى الرغم من إجراءات واضحة، وهناك عدد من النقاط الأساسية التي تعتبر حاسمة بالنسبة لنجاح الوقت تقنية التفاضلية تلطيخ. يجب أن تتعرض ذهبية لصبغ الحبيبات الخيطية الغنية للمرة المخصصة في البروتوكول. سوف تعرض أقصر يؤدي ذلك إلى ضعف الإقبال على صبغ من قبل خلايا الحبيبات الخيطية الغنية (أي ionocytes). أثناء التثبيت، يجب رفعه الأنسجة الخيشومية بسرعة وأبقى في الظلام لتجنب الصورة التبييض. يجب أن تتم معالجة الأنسجة للتصوير في حدود 2 أسابيع من التثبيت. خلال العصب إجراء باجتزاء الثنائي ضمان أن الأسماك هي الخدر بشكل جيد؛ يتم تحديد الأعصاب والأوعية الدموية بوضوح؛ وتستأنف الأسماك وظيفة وصادي كامل قبل أن يتم نقله إلى خزان الانتعاش.
"> وتقدم بيئة FW السمك مع التحدي المزدوج للموازنة خسائر أيون سلبية وناضح مكاسب المياه 14. إن موازنة الخسائر أيون سلبية يحدث عن طريق امتصاص نشط من الملح عبر المرحلية التي تكون مترجمة إلى filamental وظهائر رقائقي حيث يمكن إجراء اتصال مباشر مع البيئة الخارجية 2،4،8،9،16. ومع ذلك، فإن موقع المرحلية على الخيشومية ليس جامدا. وعلى مدى العقود الثلاثة الماضية أظهرت عدد من الدراسات أن العديد من أنواع الأسماك FW، عندما واجه مع التحدي الأيونية و / أو درجة الحرارة، وإعادة توزيع الشهادات المرحلية خيشومي من خيوط أو قاعدة الصفيحة إلى المناطق الأكثر القاصي من الصفيحة 1،2،4،5،17-21. هذا إعادة توزيع قد يزيد من سماكة الصفيحة التي يمكن التنازل نقل الغاز (O 2، CO 2) عبر الظهارة الخيشومية واستخدمت 22. الباحثون تقنية اختلاف التوقيت تلطيخ وصفها في هذه المخطوطة لتتبع نقل وemergenc(ه) من المرحلية جديدة على ظهائر الخيشومية في ظل هذه الظروف التجريبية المختلفة (الشكل 1C) 1،4،5.الخياشيم، ويفترض المرحلية الخيشومية، ومعصب من قبل التاسع والعاشر الأعصاب القحفية 7،23-25. هذه الأعصاب تحمل كل من ناقل والمدخلات وارد من وإلى الخيشومية، على التوالي. وهي تقع في الجانب الظهري من الشدق وراء ال 4 الخيشومية القوس. سهولة الحصول على الأعصاب والسهولة التي يمكن أن يؤديها الإجراء إزالة التعصيب الثنائي هو نوع معين. في سمك السلمون المرقط، على سبيل المثال، وعلم التشريح وأشار وبالارض من الرأس يسمح للأعصاب للكذب في طائرة واحدة وراء ال 4 الخيشومية قوس تحت طبقة رقيقة من الأنسجة. وهذا يجعل الأعصاب وضوحا ويمكن الوصول إليها بسهولة للباحث لتنفيذ الإجراء إزالة التعصيب. في المقابل، ذهبية لها خطم أقصر ورأس مستدير. في التاسع والعاشر من الأعصاب القحفية ذهبية تكمن أعمق في سي الظهريةدي من تجويف بعد 4 تشرين الخيشومية قوس الاحتلال طائرات مختلفة. هذا التوجه يحد من سهولة الوصول إلى الأعصاب ويتطلب نهجا أكثر حذرا لتحديد وقطع الأعصاب المناسبة. والهدف من هذا الإجراء هو إزالة التعصيب لإزالة الحسي وارد وصادر المدخلات من وإلى الخيشومية، على التوالي. ويمكن أيضا إزالة التعصيب من الأقواس الخيشومية أن يقترن مع التجارب تدفق أيون باستخدام النظائر المشعة (على سبيل المثال، 22 نا). هذه التقنيات يمكن استخدامها جنبا إلى جنب لدراسة مساهمة المدخلات العصبي على حركة الأيونات عبر الظهارة الخيشومية. الحد أخرى إلى إجراء إزالة التعصيب هو عدم القدرة على التمييز بين الخلايا العصبية الحسية والحركية، وبالتالي عندما قطع العصب حزمة من الممكن أن كلا النوعين من تعصيب يتم إزالتها. قطع أي الخلايا العصبية الحركية قد تؤثر على الخيشومية والحركة وصادي من الأسماك. وهكذا عند تنفيذ التجارب إزالة التعصيب الخيشومية من المهم أيضا لمراقبة التهوية بعدوتعافى الأسماك من الإجراء لضمان أن هناك حركة الخيشومية كافية لكل من الغاز والتبادل الأيوني.
البروتوكولات وصفها في هذه المخطوطات الحيوانات الكبار استخدام أبقت على ضوء 00:12: دورة الظلام وتغذية الكريات الغذائية التجارية. يمكن تعديل هذه الطرق في عدة طرق. أولا، فترة نقاهة بعد الحبيبات الخيطية الغنية التعرض صبغ يمكن تعديلها لمتطلبات بروتوكول الباحث (على سبيل المثال، 1، 3، 5، أو 14 يوما). وكانت أطول فترة من الانتعاش بعد التعرض للالحبيبات الخيطية الغنية صبغ في المختبر 14 يوما 4،5. لم يكن هناك انخفاض ملحوظ في كثافة مضان من صبغ الحبيبات الخيطية الغنية بعد 14 يوما من الانتعاش. ثانيا، استخدام الأجسام المضادة الأولية α-5 يقتصر على تحديد فقط الخلايا NKA الغنية ولا يميز بين أنواع فرعية مختلفة من المرحلية الخيشومية. لحسن الحظ، في ذهبية ثبت أن غالبية المرحلية على حد سواء mitochondrأيون الغنية (التسمية مع MitoTracker) وNKA الغنية (التسمية مع α-5) خلايا والتي قد لا يكون هذا هو الحال في جميع أنواع الأسماك 4،27. يمكن التجارب المستقبلية تركز على إثر إعادة توزيع الزمني لأنواع فرعية محددة IC باستخدام الأجسام المضادة الموجهة تحديدا ضد مجموعة متنوعة من القنوات والمضخات والمبادلات (على سبيل المثال، NHE، H + مضخة). وجدت دراسات سابقة أن غالبية ionocytes ملطخة-الحبيبات الخيطية الغنية صبغ المعرض NKA مناعية 4. يمكن الكشف عن تعصيب المرحلية باستخدام الأجسام المضادة الأولية ضد الخلايا العصبية محددة مستضد المستمدة من الزرد (الزنك، 12). في هذه الدراسة، α-5 و تم الكشف عن الأجسام المضادة الأولية باستخدام نفس الأجسام المضادة الثانوية (اليكسا فلور 488) لكل 12 الزنك. ويرجع هذا الحد على كل من الأجسام المضادة الأولية تثار في مجموعة الماوس والتغلب عليها حقيقة أن الخلايا NKA الغنية والخلايا العصبية يمكن تمييزها شكليا على الرغم من أنها يتألق نفس اللون. تلطيخ متسلسلمع الأجسام المضادة الثانوية المختلفة (على سبيل المثال، أول α-5 مع اليكسا فلور 488 ثم زد-12 مع اليكسا فلور 594) يمكن أن تستخدم أيضا للقضاء على مشكلة وجود كل علامات الاستشعاع نفس اللون. وأخيرا، يمكن تعديل البروتوكول باجتزاء العصبية ثنائي كامل لاستهداف الأعصاب إلى الأقواس الخيشومية محددة. على سبيل المثال، انتقائية باجتزاء العصبية يمكن أن يؤديها في أول قوس الخيشومية عن طريق فصل بلطف الأولى والثانية الأقواس الخيشومية لفضح الأعصاب مما يؤدي إلى أول قوس الخيشومية في نهاية الظهري للسلة الخيشومية (الشكل 2B-E). ويمكن أيضا أن تقنية اختلاف التوقيت تطبيقها على دراسة توزيع ionocytes في الأسماك الزرد اليرقات حيث تطوير والتحولات النقل أيون من الجلد إلى الخيشومية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank William Fletcher for animal care at the University of Ottawa. The authors would also like to thank Dr. William Milsom for teaching VT the full bilateral denervation technique at the University of British Columbia. A travel grant for this research was provided by the Faculty of Graduate and Postgraduate Studies at the University of Ottawa. This research is also supported by NSERC PGS-D scholarship to VT and Discovery Grants Program to SFP.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| MitoTracker Red | Life Technologies | M-7512 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Alrdich | D2650 | |
| α-5 primary antibody | Develompental Hybridoma Bank | a5 | |
| zn12 primary antibody | Develompental Hybridoma Bank | zn12 | |
| Alexa Fluor 488 (anti mouse) | Life Technologies | A-11001 | |
| Benzocaine | Sigma Alrdich | E1501 | 4-Aminobenzoic acid ethyl ester, Ethyl 4-aminobenzoate |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | straight |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | curved |
| Dumont No. 5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Tissue retractor | Fine Science Tools | 17009-07 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Alrdich | P6148 | |
| Triton X | Sigma Alrdich | X100 | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Katoh, F., Kaneko, T. Short-term transformation and long-term replacement of branchial chloride cells in killifish transferred from seawater to freshwater, revealed by morphofunctional observations and a newly established ‘time-differential double fluorescent staining’ technique. J. Exp. Biol. 206 (22), 4113-4123 (2003).
- Perry, S. F. Relationships between branchial chloride cells and gas transfer in freshwater fish. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 119 (1), 9-16 (1998).
- Sollid, J., Weber, R. E., Nilsson, G. E. Temperature alters the respiratory surface area of crucian carp Carassius carassius and goldfish Carassius auratus. J. Exp. Biol. 208 (6), 1109-1116 (2005).
- Mitrovic, D., Perry, S. F. The effects of thermally induced gill remodeling on ionocyte distribution and branchial chloride fluxes in goldfish (Carassius auratus). J. Exp. Biol. 212 (6), 843-852 (2009).
- Tzaneva, V., Vadeboncoeur, C., Ting, J., Perry, S. F. Effects of hypoxia-induced gill remodelling on the innervation and distribution of ionocytes in the gill of goldfish, Carassius auratus. J. Comp. Neurol. 522 (1), 118-130 (2014).
- Greco, A. M., Fenwick, J. C., Perry, S. F. The effects of soft-water acclimation on gill structure in the rainbow trout Oncorhynchus mykiss. Cell Tissue Res. 285 (1), 75-82 (1996).
- Jonz, M. G., Nurse, C. A. Epithelial mitochondria-rich cells and associated innervation in adult and developing zebrafish. J. Comp. Neurol. 497 (5), 817-832 (2006).
- Laurent, P., Hebibi, N. Gill morphometry and fish osmoregulation. Can. J. Zool. 67 (12), 3055-3063 (1989).
- Perry, S. F., Laurent, P. Adaptational responses of rainbow trout to lowered external NaCL concentration: contribution of the branchial chloride cell. J. Exp. Biol. 147, 147-168 (1989).
- Evans, D. H., Piermarini, P. M., Choe, K. P. The multifunctional fish gill: dominant site of gas exchange, osmoregulation, acid-base regulation, and excretion of nitrogenous waste. Physiol. Rev. 85 (1), 97-177 (2005).
- Hwang, P. P., Lee, T. H., Lin, L. Y. Ion regulation in fish gills: recent progress in the cellular and molecular mechanisms. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 301 (1), R28-R47 (2011).
- Krogh, A. The Active Uptake of Ions into Cells and Organisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 25 (6), 275-277 (1939).
- Nilsson, G. E., Randall, D. J., Hoar, W. S. Innervation and pharmacology of the gills. Fish Physiology. , 185-272 (1984).
- Sundin, L., Nilsson, S. Branchial innervation. J. Exp. Zool. 293 (3), 232-248 (2002).
- Dymowska, A. K., Hwang, P. P., Goss, G. G. Structure and function of ionocytes in the freshwater fish gill). Respir. Physiol. Neurobiol. 184 (3), 282-292 (2012).
- Witters, H., Berckmans, P., Vangenechten, C. Immunolocalization of Na+/K+-ATPase in the gill epithelium of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Cell Tissue Res. 283 (3), 461-468 (1996).
- Bindon, S., Fenwick, J. C., Perry, S. F. Branchial chloride cell proliferation in the rainbow trout, Onchorhynchus mykiss: implications for gas transfer. Can. J. Zool. 72 (8), 1395-1402 (1994).
- Bradshaw, J. C., Kumai, Y., Perry, S. F. The effects of gill remodeling on transepithelial sodium fluxes and the distribution of presumptive sodium-transporting ionocytes in goldfish (Carassius auratus). J. Comp. Physiol. B. 182 (3), 351-366 (2012).
- Chou, M. Y., et al. Effects of hypothermia on gene expression in zebrafish gills: upregulation in differentiation and function of ionocytes as compensatory responses. J. Exp. Biol. 211 (19), 3077-3084 (2008).
- Kaneko, T., Katoh, F. Functional morphology of chloride cells in killifish Fundulus heteroclitus, a euryhaline teleost with seawater preference. Fisheries Science. 70 (5), 723-733 (2004).
- Ouattara, N., et al. Changes in gill ionocyte morphology and function following transfer from fresh to hypersaline waters in the tilapia Sarotherodon melanotheron. Aquaculture. 290 (1-2), 155-164 (2009).
- Bindon, S., Gilmour, K., Fenwick, J., Perry, S. The effects of branchial chloride cell proliferation on respiratory function in the rainbow trout, Oncorhynchusmykiss. J. Exp. Biol. 197 (1), 47-63 (1994).
- Dunel-Erb, S., Bailly, Y., Laurent, P. Pattern of gill innervation in two teleosts, the perch and the trout. Can. J. Zool. 71, 18-25 (1993).
- Jonz, M. G., Nurse, C. A. New developments on gill innervation: insights from a model vertebrate. J. Exp. Biol. 211 (15), 2371-2378 (2008).
- Jonz, M. G., Zaccone, G. Nervous control of the gills. Acta Histochem. 111 (3), 207-216 (2009).
- Milsom, W. K., Reid, S. G., Rantin, F. T., Sundin, L. Extrabranchial chemoreceptors involved in respiratory reflexes in the neotropical fish, Colossoma macropomum (the tambaqui). J. Exp. Biol. 205 (12), 1765-1774 (2002).
- Hwang, P., Lee, T. New insights into fish ion regulation and mitochondrion-rich cells. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 148 (3), 479-497 (2007).
