Automated quantification des cellules hématopoïétiques - Interactions cellulaires stromales dans les images histologiques de décalcifiées os
Summary
A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.
Abstract
La microscopie confocale est la méthode de choix pour l'analyse de la localisation des multiples types de cellules au sein des tissus complexes tels que la moelle osseuse. Cependant, l'analyse et la quantification de localisation cellulaire est difficile, comme dans de nombreux cas, il se appuie sur le comptage manuel, portant ainsi le risque d'introduire un biais de l'évaluateur-dépendante et réduire fiabilité inter. En outre, il est souvent difficile de juger si la co-localisation entre deux cellules résulte de positionnement aléatoire, en particulier lorsque des types de cellules diffèrent fortement de la fréquence de leur occurrence. Ici, un procédé de quantification non biaisée de la co-localisation cellulaire dans la moelle osseuse est introduite. Le protocole décrit la préparation de l'échantillon utilisé pour obtenir des coupes histologiques de entiers os longs murins y compris la moelle osseuse, ainsi que le protocole de coloration et l'acquisition d'images à haute résolution. Un flux de travail d'analyse allant de la reconnaissance de hématopoïétiques et non-hematopoietic types de cellules dans deux dimensions des images de moelle (2d) de l'os à la quantification des contacts directs entre les cellules est présentée. Cela inclut également une analyse de voisinage, afin d'obtenir des informations sur le microenvironnement cellulaire entourant un certain type de cellule. Afin d'évaluer si la co-localisation de deux types de cellules est la simple conséquence de positionnement cellulaire aléatoire ou reflète associations préférentielles entre les cellules, un outil de simulation qui permet de tester cette hypothèse dans le cas d'hématopoïétiques ainsi que des cellules stromales, est utilisé. Cette approche ne est pas limitée à la moelle osseuse, et peut être étendue à d'autres tissus pour permettre une analyse reproductible, quantitative des données histologiques.
Introduction
En raison des récents développements technologiques rapides dans la microscopie, y compris l'imagerie optique, l'analyse de cellules dans le contexte du tissu entier est devenu de plus en plus accessible pour les immunologistes. La caractérisation des cellules individuelles en suspension représente une méthode utile et indispensable pour comprendre la fonction cellulaire et moléculaire. Cependant, l'analyse des cellules au sein de leur (micro) -anatomical environnement est essentielle pour comprendre les interactions entre les différents types de cellules qui collaborent dans des processus complexes tels que le développement des réponses immunitaires.
Se il est relativement facile pour microscopistes pour obtenir des informations qualitatives à partir d'images, il reste un défi de quantifier ces données, en partie en raison du fait que les méthodes d'analyse dans ce domaine sont à la traîne par rapport à ce qui est possible dans l'acquisition de l'image. De nombreux chercheurs se appuient toujours sur de temps comptage cellulaire manuel dans leurs images d'histologie,introduisant ainsi un biais entre les différents évaluateurs et d'entraver la réplication par d'autres groupes. Souvent, une image représentative est choisie pour souligner une déclaration sur la position cellulaire ou co-localisation dans une publication, ce qui rend difficile pour le lecteur de juger de la pertinence statistique d'un tel événement.
Ensemble, avec le fait que le contenu de l'information complète de données d'image est rarement exploitée, ce qui souligne la nécessité d'une approche plus impartiale, rapide et complète pour analyser les images histologiques.
La moelle osseuse est un tissu complexe, qui prend les fonctions vitales importantes comme l'organe de l'hématopoïèse chez les vertébrés adultes. En plus d'être le lieu de naissance pour les cellules hématopoïétiques 1,2 et de jouer un rôle important dans le développement des lymphocytes B 3, il agit également comme un site où les réactions immunitaires sont initiées 4 et soutient les cellules matures, recirculation B 5. En outre, son rôle dans le maintien imémoire mmunological est devenu de plus en plus apprécié dans la dernière décennie, car plusieurs types de cellules constituant la mémoire immunitaire ont été trouvés d'y résider 6-9.
La relation entre l'architecture tissulaire complexe de la moelle osseuse et de ses fonctions restent toujours insaisissables. Contrairement organes lymphoïdes secondaires, qui sont organisés en macro-compartiments tels que les zones de cellules T et B, la moelle osseuse n'a pas de macro-cloisonnement clair. Jusqu'à présent compartiments distincts dans la moelle osseuse sont définis par leur proximité par rapport au cortex de l'os ou de la vascularisation. L'importance des différentes populations de cellules stromales résident dans la moelle osseuse pour un certain nombre de procédés tels que l'appui des cellules souches, le développement des cellules B ou le maintien de populations de cellules de mémoire immunitaire (tels que les cellules de plasma à long terme (PC), CD4 + et Les cellules CD8 + T mémoires) indique clairement qu'il existe un certain degré de micro-compartimentation dans la moelle osseuse.
<pclass = "jove_content"> Ces observations ont conduit à la notion de niches micro-anatomiques distincts, qui sont spécialisés dans certaines fonctionnalités (STEM entretien des cellules, le développement des cellules B à divers stades, et l'entretien de la mémoire immunologique) dans la moelle osseuse. Bien qu'il semble y avoir un certain degré d'hétérogénéité entre les niches qui servent différentes fonctions, certains des facteurs produits par les cellules stromales, comme CXC chimiokine ligand 12 (CXCL12) ou l'interleukine 7 (IL-7), sont des éléments cruciaux pour plusieurs de ces niches 10. La visualisation et la caractérisation de cellules stromales de la moelle osseuse est difficile en raison de leurs caractéristiques morphologiques avec de longues extensions dendritiques minces formant un réseau dans la moelle osseuse, et l'absence de marqueurs appropriés de discriminer les sous-populations stromales.Il ne est pas encore clair dans quelle mesure ces niches ont des caractéristiques communes à l'égard de leur compositio cellulaire et moléculairen, et qui rendent éléments un certain créneau unique. En plus des cellules stromales, des types de cellules hématopoïétiques ont été montrés pour jouer un rôle crucial en fournissant certains signaux au moins pour une partie des créneaux. De toute évidence, la complexité de la composition de niche nécessite leur analyse in situ, et il est devenu de plus en plus important pour les immunologistes et hématologues de zoomer sur la microarchitecture de la moelle osseuse, par exemple, en analysant les relations spatiales entre ses composants cellulaires.
Ici, une stratégie visant à quantifier la co-localisation et de voisinage relations cellulaires dans la moelle osseuse d'une manière automatisée et impartiale est présenté. Un flux de travail détaillé incluant la génération de souris chimériques, l'hébergement cellules fluorescentes stromales et les cellules hématopoïétiques non-fluorescentes, à la préparation de coupes histologiques d'os non décalcifiées, l'acquisition d'images confocales couvrant l'ensemble de l'os, ainsi que l'analyse d'image automatisée de c cellulaireo-localisation et de sa validation / discrimination de positionnement aléatoire par un outil de simulation est fourni (figure 8).
Protocol
Representative Results
Discussion
Malgré les progrès dans les méthodes modernes d'imagerie optique, l'analyse des données histologiques est encore souvent entravé par le manque d'outils de quantification appropriés et des méthodes, ou par des analyses biaisées qui se concentrent sur une petite zone d'intérêt. L'approche synergique présenté ici combine l'analyse d'image couvrant la région de la moelle osseuse entière, la segmentation automatique et la reconnaissance d'objets de divers types de cellules hémat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Andreas Radbruch pour des discussions intéressantes. Nous sommes reconnaissants à Sabine Gruczek, Patrick Thiemann et Manuela Ohde de l'aide pour les soins aux animaux et Robert Günther pour une excellente assistance technique. Nous remercions nos évaluateurs formés Laura Oehme, Jannike Bayat-Sarmadi, Karolin Pollok, Katrin Roth, Florence Pache et Katharina Corne de l'évaluation des échantillons histologiques et Randy Lindquist pour la relecture du manuscrit. Nous remercions J. et N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, Arizona, Etats-Unis pour des anticorps spécifiques MBP.
Ce travail a été soutenu par DFG HA5354 / 4-1, par-JIMI une subvention de réseau d'installations de base pour la microscopie intravitale DFG et en TRR130 / TP17, et la DFG POUR 2165 (HA5354 / 6-1) pour AEHSZ a été soutenue par l'International Max Planck l'école pour les maladies infectieuses et l'immunologie (IMPRS-IDI), Berlin.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Neomycin | Sigma | N6386 SIGMA | Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08; www.sigmaaldrich.com |
| Ursovit AD3EC | Serumwerke Bernburg | 1 ml contains: 50.000 I.E retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate | |
| Transfer buffer (100ml PBS, 1ml 1M HEPES, 50U/ml Penicillin/Streptomycin) | Sigma | P4333 Sigma H3375 Sigma | www.sigmaaldrich.com |
| 4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin) | |||
| Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg | Rockland | D602-0100 | www.rockland-inc.com |
| 20 % Paraformaldehyde solution (EM-grade) | Science Services | 15713 | EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08 |
| D(+)-Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | www.carlroth.com |
| Dry ice | |||
| Acetone | Sigma.Aldrich | 179124 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07; www.sigmaaldrich.com |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 208752 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09; www.sigmaaldrich.com |
| Tissue-Tek cryomolds (standard) | Sakura | 4557 | 25 x 20 x 5 mm; www.sakuraus.com |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | www.sakuraus.com |
| Kawamoto's SCEM embedding medium | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Kawamoto's cryosection preparation kit | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Kawamoto's cryofilm type 2C(9) | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Microtome blade MX35 Premier Plus, Low Profile | Thermo Scientific | 3052835 | L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01");www.thermoscientific.com |
| polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated | Rockland | 600-406-379 | www.rockland-inc.com |
| Alexa Fluor 555 streptavidin | Life Technologies | S-32355 | www.lifetechnologies.com |
| rat anti-MBP | J. and N. Lee | available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7 | |
| goat anti-rat-Alexa Fluor 647 | Life Technologies | A-21247 | www.lifetechnologies.com |
| rat anti-B220 – Alexa Fluor 594 | produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies | ||
| mouse anti-l1 light chain -FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136 | ||
| rat anti-k light chain – FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1 | ||
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma | D9542 SIGMA | www.sigmaaldrich.com |
| Fluorescent mounting medium | DAKO | S3023 | www.dako.com |
| Cover slips (24mm x 24mm x 0.13-0.16 mm) | Carl Roth | H875.2 | www.carlroth.com |
| Superfrost slides glasses (75 mm x 25 mm) | VWR | 48311-703 | www.vwr.com |
| Laser scanning confocal microscope | equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20x/0.8 NA air objective lens; We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software. | ||
| Automated image analysis tools for bone marrow | Wimasis, Munich | The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request: www.wimasis.de | |
| VC2012 Runtime | Microsoft | free download: http://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=30679 | |
| Simulation tool for random cell positioning | available from us, upon request | ||
| Image analysis software with image segmentation functions | We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download: http://www.cellprofiler.org) | ||
| Fiji image analysis software | free download: http://fiji.sc/Fiji. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3). |
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