Geautomatiseerde kwantificering van hematopoietische cellen - stromale cel interacties in histologische afbeeldingen van ontkalkte Bone
Summary
A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.
Abstract
Confocale microscopie is de voorkeurswerkwijze voor de analyse van de lokalisatie van meerdere celtypen binnen complexe weefsels zoals het beenmerg. De analyse en kwantificering van cellulaire lokalisatie is moeilijk, omdat in veel gevallen het berust op handmatige telling, waardoor met het risico van het introduceren van een beoordelaar afhankelijke voorspanning en verminderen interwaarnemersbetrouwbaarheid. Bovendien is het vaak moeilijk te beoordelen of de co-lokalisatie tussen twee cellen resulteert uit willekeurige positie, vooral wanneer celtypen sterk verschillen in de frequentie van voorkomen. Hier wordt een werkwijze voor onpartijdige kwantificering van cellulaire co-localisatie in het beenmerg ingevoerd. Het protocol beschrijft de bereiding van de monsters gebruikt voor histologische coupes van de hele muizen lange botten, waaronder het beenmerg te verkrijgen, evenals de kleuringsprotocol en de overname van beelden met hoge resolutie. Een analyse workflow variërend van de erkenning van hematopoietische en niet-Hematopoietic celtypes in 2-dimensionale (2D) beenmerg beelden naar de kwantificering van de rechtstreekse contacten tussen die cellen wordt gepresenteerd. Dit omvat tevens een wijk analyse, om informatie over de cellulaire micromilieu rond een bepaald celtype verkrijgen. Om te beoordelen of co-lokalisatie van twee celtypen is de resultante van willekeurige cel positioneren of reflecteert preferentiële associaties tussen de cellen een simulatie instrument dat geschikt is voor het testen van deze hypothese bij hematopoïetische en stromale cellen, is gebruikt. Deze benadering is niet beperkt tot het beenmerg, en kan worden uitgebreid tot andere weefsels reproduceerbare, kwantitatieve analyse van histologische gegevens mogelijk.
Introduction
Door recente snelle technologische ontwikkelingen microscopie, waaronder optische, heeft de analyse van cellen in de context van het gehele weefsel steeds toegankelijker voor immunologen worden. De karakterisering van afzonderlijke cellen in suspensie een waardevolle en onmisbare methode cellulaire en moleculaire functie begrijpen. De analyse van de cellen in hun (micro) -anatomical milieu essentieel voor het begrijpen van de interacties tussen verschillende celtypen die samenwerken in complexe processen zoals de ontwikkeling van immuunresponsen.
Hoewel het relatief gemakkelijk microscopisten kwalitatieve informatie uit beelden te verkrijgen, blijft het een uitdaging om deze gegevens te kwantificeren, mede door het feit dat analysemethoden op dit gebied blijft achter met wat mogelijk is in beeldacquisitie. Veel onderzoekers nog steeds rekenen op tijdrovende handmatige cel tellen in hun histologie beelden,om zo voor een vertekening tussen de verschillende beoordelaars en belemmeren replicatie door andere groepen. Vaak wordt een representatief beeld gekozen om een verklaring over cellulaire positie of co-lokalisatie onderstrepen in een publicatie, waardoor het moeilijk voor de lezer om de statistische relevantie van een dergelijke gebeurtenis te beoordelen.
Samen met het feit dat de volledige informatie-inhoud van beeldgegevens zelden wordt uitgebuit, benadrukt dit de noodzaak van een meer onpartijdige, sneller en alomvattende aanpak van de histologische beelden te analyseren.
Het beenmerg een complex weefsel dat neemt belangrijke vitale functies als orgaan van hematopoiese bij volwassen vertebraten. Naast het feit dat de geboorteplaats van hematopoietische cellen 1,2 en spelen een belangrijke rol in de B-lymfocyten ontwikkeling 3, fungeert het ook als een site waar immuunreacties worden geïnitieerd 4 en ondersteunt volwassen, recirculatie B-cellen 5. Daarnaast zijn rol in het handhaven van immunological geheugen is steeds meer gewaardeerd in de afgelopen tien jaar, zoals verschillende soorten cellen vormen immunologisch geheugen zijn gevonden aldaar te verblijven 6-9.
De verhouding tussen het complex weefsel architectuur van het beenmerg en de functies nog steeds blijven ongrijpbaar. In tegenstelling tot de secundaire lymfoïde organen, die worden georganiseerd in macro-compartimenten zoals T- en B-cel zones, het beenmerg ontbreekt een duidelijke macro-verkokering. Tot dusver verschillende compartimenten in het beenmerg worden gedefinieerd door hun nabijheid tot de botcortex of vasculatuur. Het belang van de verschillende resident stromale cel populaties in het beenmerg voor een aantal processen zoals ondersteuning stamcellen, ontwikkeling van B-cellen of het onderhoud van immuungeheugen celpopulaties (zoals langlevende plasmacellen (PC), CD4 + en CD8 + geheugen T-cellen) blijkt duidelijk dat er een zekere mate van micro-compartimentering in het beenmerg.
<pclass = "jove_content"> Deze waarnemingen hebben geleid tot het concept afzonderlijke microanatomical nissen, die gespecialiseerd zijn in bepaalde functionaliteiten (stamcel onderhoud, B-cel ontwikkeling in diverse stadia en onderhoud van immunologisch geheugen) in het beenmerg. Hoewel er lijkt een zekere mate van heterogeniteit tussen de nissen die verschillende functies te dienen sommige van de door stromale cellen, zoals CXC-chemokine ligand 12 (CXCL12) of interleukine 7 (IL-7), factoren cruciale onderdelen voor verscheidene van deze niches 10. De visualisatie en karakterisatie van stromale cellen in het beenmerg is moeilijk vanwege hun morfologische kenmerken met lange, dunne dendritische verlengingen vormen van een netwerk in het beenmerg en het ontbreken van geschikte markers om stromale subpopulaties discrimineren.Het is nog niet duidelijk in hoeverre deze niches gemeenschappelijke kenmerken met betrekking tot hun cellulaire en moleculaire composition, en welke elementen maken een bepaalde niche uniek. Naast stromale cellen, hematopoëtische celtypen hebben aangetoond dat het een cruciale rol spelen door bepaalde signalen althans voor sommige niches. Is duidelijk dat de complexiteit van de niche preparaat vereist de analyse in situ, en het is steeds belangrijker geworden voor immunologen en hematologen inzoomen op beenmerg microarchitectuur, bijvoorbeeld door analyse van de ruimtelijke relaties tussen de cellulaire componenten.
Hier strategie cellulaire co-localisatie en buurt verhoudingen in het beenmerg op geautomatiseerde en onpartijdige wijze kwantificeren gepresenteerd. Een gedetailleerde workflow inclusief het genereren van chimere muizen harboring fluorescerende stromale cellen en niet fluorescerende hematopoietische cellen, bereiding van histologische coupes van niet ontkalkte beenderen, verwerving van confocale afbeeldingen die het gehele bot, en de geautomatiseerde beeldanalyse van cellulaire co-lokalisatie en de validatie / discriminatie van willekeurige positionering door een simulatie-tool is voorzien (Figuur 8).
Protocol
Representative Results
Discussion
Ondanks de vooruitgang in de moderne optische beeldvorming methoden, is de analyse van histologische gegevens nog vaak gehinderd door het ontbreken van een goede kwantificering instrumenten en methoden, of door bevooroordeelde analyses die zich richten op een klein gebied van belang. De synergetische aanpak hier gepresenteerde combineert beeldanalyse die het hele beenmerg regio, geautomatiseerde segmentatie en het herkennen van objecten van verschillende hematopoietische en stromale celtypen, co-lokalisatie analyse, en …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Andreas Radbruch voor waardevolle discussies. We zijn dankbaar voor Gruczek, Patrick Thiemann en Manuela Ohde Sabine voor hulp bij de verzorging van dieren en Robert Günther voor een uitstekende technische bijstand. Wij danken onze getrainde beoordelaars Laura Oehme, Jannike Bayat-Sarmadi, Karolin Pollok, Katrin Roth, Florence Pache en Katharina Hoorn voor de evaluatie van de histologie monsters en Randy Lindquist voor het proeflezen van het manuscript. Wij danken J. en N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, Arizona, USA voor MBP-specifieke antilichamen.
Dit werk werd ondersteund door DFG HA5354 / 4-1, van Jimi-een DFG kernfaciliteit netwerk subsidie voor opklaren en door TRR130 / TP17, en DFG VOOR 2165 (HA5354 / 6-1) te AEHSZ werd gesteund door de International Max Planck School voor Infectieziekten en Immunologie (IMPRS-IDI), Berlijn.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Neomycin | Sigma | N6386 SIGMA | Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08; www.sigmaaldrich.com |
| Ursovit AD3EC | Serumwerke Bernburg | 1 ml contains: 50.000 I.E retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate | |
| Transfer buffer (100ml PBS, 1ml 1M HEPES, 50U/ml Penicillin/Streptomycin) | Sigma | P4333 Sigma H3375 Sigma | www.sigmaaldrich.com |
| 4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin) | |||
| Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg | Rockland | D602-0100 | www.rockland-inc.com |
| 20 % Paraformaldehyde solution (EM-grade) | Science Services | 15713 | EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08 |
| D(+)-Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | www.carlroth.com |
| Dry ice | |||
| Acetone | Sigma.Aldrich | 179124 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07; www.sigmaaldrich.com |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 208752 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09; www.sigmaaldrich.com |
| Tissue-Tek cryomolds (standard) | Sakura | 4557 | 25 x 20 x 5 mm; www.sakuraus.com |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | www.sakuraus.com |
| Kawamoto's SCEM embedding medium | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Kawamoto's cryosection preparation kit | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Kawamoto's cryofilm type 2C(9) | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Microtome blade MX35 Premier Plus, Low Profile | Thermo Scientific | 3052835 | L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01");www.thermoscientific.com |
| polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated | Rockland | 600-406-379 | www.rockland-inc.com |
| Alexa Fluor 555 streptavidin | Life Technologies | S-32355 | www.lifetechnologies.com |
| rat anti-MBP | J. and N. Lee | available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7 | |
| goat anti-rat-Alexa Fluor 647 | Life Technologies | A-21247 | www.lifetechnologies.com |
| rat anti-B220 – Alexa Fluor 594 | produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies | ||
| mouse anti-l1 light chain -FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136 | ||
| rat anti-k light chain – FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1 | ||
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma | D9542 SIGMA | www.sigmaaldrich.com |
| Fluorescent mounting medium | DAKO | S3023 | www.dako.com |
| Cover slips (24mm x 24mm x 0.13-0.16 mm) | Carl Roth | H875.2 | www.carlroth.com |
| Superfrost slides glasses (75 mm x 25 mm) | VWR | 48311-703 | www.vwr.com |
| Laser scanning confocal microscope | equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20x/0.8 NA air objective lens; We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software. | ||
| Automated image analysis tools for bone marrow | Wimasis, Munich | The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request: www.wimasis.de | |
| VC2012 Runtime | Microsoft | free download: http://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=30679 | |
| Simulation tool for random cell positioning | available from us, upon request | ||
| Image analysis software with image segmentation functions | We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download: http://www.cellprofiler.org) | ||
| Fiji image analysis software | free download: http://fiji.sc/Fiji. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3). |
References
- Kunisaki, Y., Frenette, P. S. The secrets of the bone marrow niche: Enigmatic niche brings challenge for HSC expansion. Nat Med. 18, 864-865 (2012).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505, 327-334 (2014).
- Tokoyoda, K., Egawa, T., Sugiyama, T., Choi, B. I., Nagasawa, T. Cellular niches controlling B lymphocyte behavior within bone marrow during development. Immunity. 20, 707-718 (2004).
- Cariappa, A., et al. Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes. Immunity. 23, 397-407 (2005).
- Sapoznikov, A., et al. Perivascular clusters of dendritic cells provide critical survival signals to B cells in bone marrow niches. Nat Immunol. 9, 388-395 (2008).
- Tokoyoda, K., et al. Professional memory CD4+ T lymphocytes preferentially reside and rest in the bone marrow. Immunity. 30, 721-730 (2009).
- Mazo, I. B., et al. Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells. Immunity. 22, 259-270 (2005).
- Lin, G. H., et al. Contribution of 4-1BBL on radioresistant cells in providing survival signals through 4-1BB expressed on CD8(+) memory T cells in the bone marrow. Eur J Immunol. 42, 2861-2874 (2012).
- Zehentmeier, S., et al. Static and dynamic components synergize to form a stable survival niche for bone marrow plasma cells. Eur J Immunol. 44, 2306-2317 (2014).
- Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nat Rev Immunol. 6, 107-116 (2006).
- Luche, H., Weber, O., Nageswara Rao, T., Blum, C., Fehling, H. J. Faithful activation of an extra-bright red fluorescent protein in ‘knock-in’ Cre-reporter mice ideally suited for lineage tracing studies. Eur J Immunol. 37, 43-53 (2007).
- Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. A cre-transgenic mouse strain for the ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. Nucleic Acids Res. 23, 5080-5081 (1995).
- Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66, 123-143 (2003).
- Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot’s film method. Arch Histol Cytol. 1130 (2012), 149-164 (2012).
- Smith, C. L., et al. Basic confocal microscopy. Current protocols in neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley … [et al.]. 2 (Unit 2.2), (2001).
- Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans. Sys., Man., Cyber. 9, 62-66 (1979).
- Hughes, I., Hase, T. . Measurements and Their Uncertainties: A Practical Guide To Modern Error Analysis. , (2010).
- Quinn, G. P., Keough, M. J. . Experimental Design and Data Analysis for Biologists. , (2002).
- Kiel, M. J., Morrison, S. J. Uncertainty in the niches that maintain haematopoietic stem cells. Nat Rev Immunol. 8, 290-301 (2008).
- MacQueen, J. B. Some Methods for classification and Analysis of Multivariate Observations. Proceedings of 5th Berkeley Symposium on Mathematical Statistics and Probability Vol. 1. , 666 (1967).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Jarjour, M., et al. Fate mapping reveals origin and dynamics of lymph node follicular dendritic cells. J Exp Med. 211, 1109-1122 (2014).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-cytometry: a method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes. Immunity. 37, 364-376 (2012).
- Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37, 351-363 (2012).
- Siffrin, V., et al. In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis. Immunity. 33, 424-436 (2010).
- Shen, Q., et al. Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions. Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).
- Danielsson, P. E. Euclidian distance mapping. Computer Graphics and Image Processing. 14, 21 (1980).
- Tellier, J., Kallies, A. Finding a home for plasma cells – a niche to survive. Eur J Immunol. , (2014).
- Winter, O., et al. Megakaryocytes constitute a functional component of a plasma cell niche in the bone marrow. Blood. 116, 1867-1875 (2010).
- Rozanski, C. H., et al. Sustained antibody responses depend on CD28 function in bone marrow-resident plasma cells. J Exp Med. 208, 1435-1446 (2011).
- Rodriguez Gomez, M., et al. Basophils support the survival of plasma cells in mice. J Immunol. 185, 7180-7185 (2010).
- Belnoue, E., et al. Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche. J Immunol. 188, 1283-1291 (2012).
- Kohler, A., et al. G-CSF-mediated thrombopoietin release triggers neutrophil motility and mobilization from bone marrow via induction of Cxcr2 ligands. Blood. 117, 4349-4357 (2011).
