דור יעיל של כתבים במכות ספציפיים Lineage hiPSC עצבי באמצעות CRISPR / Cas9 ומערכת Nickase זוגי Cas9
Summary
Genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system have greatly improved gene targeting efficiency in human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). This manuscript describes a protocol for generating lineage specific hiPSC reporter using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination.
Abstract
מיקוד גן הוא גישה ביקורתית לאפיון פונקציות גן במחקר הביו-רפואי מודרני. עם זאת, היעילות של גן המיקוד בתאים אנושיים הייתה נמוכה, המונעת את הדור של שורות תאים אנושיות בקצב רצוי. בשנתיים האחרונות היינו עדים להתקדמות מהירה בשיפור היעילות של מניפולציה גנטית על ידי כלי עריכת הגנום כגון מערכת / קאש (הקשורים CRISPR) CRISPR (אשכולות באופן קבוע Interspaced חזרות Palindromic קצרה). כתב יד זה מתאר פרוטוקול להפקת כתבי שושלת ספציפיים בתאי גזע אנושיים pluripotent מושרה (hiPSC) באמצעות מערכת CRISPR / קאש סייעה רקומבינציה ההומולוגית. הליכים לקבלת רכיבים דרושים להכנת קווי כתב שושלת עצביים באמצעות CRISPR / מערכת קאש, תוך התמקדות בבנייה של וקטורי מיקוד וRNAs מדריך היחיד, מתוארים. פרוטוקול זה יכול להתארך עד הקמת פלטפורמה ותיקון מוטציה בhiPSCs.
Introduction
CRISPR (אשכולות באופן קבוע Interspaced חזרות Palindromic קצרה) / קאש מערכת (הקשורים CRISPR), יחד עם כלי עריכת הגנום אחרים, יש מהפכה במניפולצית הגנום האנושית בשנים האחרונות 1-7. מרכיבים עיקריים במערכת / Cas9 CRISPR הם RNA מדריך יחיד (sgRNA) וCas9. Cas9 הוא הסוג השני endonuclease DNA מודרך RNA. יש לו שני תחומים nuclease, האמפ וRuvC, אשר אחראים על ביצוע הפסקות גדילי דנ"א כפולים (DSBs) באזור גנומי ספציפי ליד מוטיב סמוך protospacer יש (PAM) 7-10 .An sgRNA פונקציה משולבת של זה של crRNA וtracrRNA, שתי מולקולות RNA הסתגלות חסינות שזוהו בחיידקים (כגון סטרפטוקוקוס pyogenes) וחיידקים קדומים להילחם נגד פלישת DNA של מקורות אקסוגניים 9-11. כאשר תוכנן כראוי ושיתוף הציג לתאי יונקים, sgRNA מכיר את רצף PAM, בסיס-זוגות עם הגדיל המשלים של ה- DNA היעד, ומדריכים וtransactivates Cas9 לדבוקבשני גדילי הדנ"א באופן מיידי במעלה הזרם של 7 PAM. בהמשך לכך, בבימויו הומולוגי רקומבינציה (HDR, בנוכחותו של וקטור מיקוד) או בסוף שאינו הומולוגי שהצטרף (NHEJ) יתרחש לתקן DSBs. Transgenes כגון cDNAs, קלטות כתב, או שברים עמידים לאנטיביוטיקה יכול להיות משולב, וקווים מהונדסים או להתרפק עשו.
למרות שהמערכה / Cas9 CRISPR היא יעילה ביותר ויחסית ספציפית, לא רצויה דווחו פעילויות מחוץ יעד 12-15. כדי למזער את האירועים מחוץ היעד, nickases Cas9 (Cas9n) יש גם מהונדס 9,10,14,16,17. Cas9n (D10A Cas9 או Cas9 H840A) הוא אנזים Cas9 עם מוטציות באחד משני תחומים nuclease, שמעורר רק ניק בגדיל אחד של DNA. כדי להשיג מחשוף בשני הגדילים, שתי sgRNAs נועד להדריך את זוג nickases, אשר חותך בנפרד בלוקוסים סמוכים של שני גדילי דנ"א שונים. האסטרטגיה "nicking הכפול" דורשת מורעיצוב דואר מחמיר יותר מאשר פלטפורמת Cas9 הקונבנציונלית, ומציע גם יעילות גבוהה וסגוליים גבוהות לניסויי עריכת גן.
כתב יד זה מתאר פרוטוקול להפקת כתב שושלת ספציפי בתאי גזע אנושיים pluripotent מושרה (hiPSC) באמצעות מערכת CRISPR / קאש סייעה רקומבינציה ההומולוגית. צעדים להשגת הרכיבים הדרושים להכנת קווי כתב שושלת עצבית באמצעות CRISPR / עריכת הגנום מערכת תיווך קאש מתוארות, עם דגש על הבנייה של וקטורי מיקוד וsgRNAs. פרוטוקול זה כבר חזר בהצלחה בשורות hiPSC מרובות כוללים אלה נגזרים מאנשים בריאים ומחולים במחלות של מערכת העצבים המרכזית. גנים ממוקדים במעבדה שלנו כוללים OLIG2, HB9 (MNX1), NEUROG2, SOX1, ALDH1L1 וSOD1. מיקוד יעילות מCRISPR מערכת / קאש בתיווך רקומבינציה ההומולוגית בhiPSCs נע בין 20-40%, אשר עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים 1,18,19. בהשוואה לtypicaיעילות l של 1-2% בניסויי גן המיקוד קונבנציונליים, יעילות המיקוד משופרת באופן משמעותי.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gene targeting is an essential tool in characterizing gene functions. However, the relatively low efficiency demands labor-intensive and time-consuming work. Recently development on genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system has greatly improved the targeting efficiency. This manuscript describes a protocol for generating lineage specific human induced pluripotent stem cell (hiPSC) reporter using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination. Steps …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Department of Neurosurgery, Memorial Hermann Foundation Staman Ogilvie Fund, the Bentsen Stroke Center at the University of Texas Health Science Center at Houston, and Mission Connect TIRR Foundation.
Materials
| Name of Material/Equipment | Vendor | Catalog no. |
| pStart-K | Addgene | 20346 |
| pWS-TK6 | Addgene | 20350 |
| pKD3 | Addgene | 45604 |
| pKD46 | The Coli Genetic Stock Center, CGSC | 7634 |
| PGK-neo-bpA sequence | Addgene | 13442 |
| Human BAC clones of target genes | https://bacpac.chori.org | |
| JDS246 (Cas9-003), Mammalian codon-optimized streptococcus pyogenes Cas9-3X Flag | Addgene | 43861 |
| MLM3636, Human-gRNA-ExpressionVector with U6 promoter | Addgene | 43860 |
| pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n(D10A) | Addgene | 42335 |
| sgRNA design, ZiFit | http://zifit.partners.org/ZiFiT/ | |
| Off target prediction tool CasOT | http://eendb.zfgenetics.org/casot/download.php | |
| Perl | http://www.perl.org/get.html | |
| NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ | |
| BLAT | https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start | |
| sgRNA Primer synthesis | Sigma | |
| One shot Top10 Electrocomp E. Coli Competent cells | Life Technologies | C4040-50 |
| AccuPrime Pfx SupperMix | Life Technologies | 12344-040 |
| Restriction enzymes | NEB and Life Technologies | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Researech | D4007 |
| DNA quick extraction buffer | Epicentre | QE0905T |
| Herculase II Fusion DNA Polymerases | Agilent Technologies | 600675 |
| Digestion buffer 2 | New England Biolab | |
| 6X DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 |
| TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance | Stem Cell Technologies | 05940 |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-100 |
| 50xTAE | Life Technologies | B49 |
| Essential 8 medium | Life Technologies | A1517001 |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium and Magnesium | Life Technologies | A12856-01 |
| D-MEM/F12 with Glutamax | Life Technologies | 10565018 |
| D-MEM with Glutamax | Life Technologies | 10566040 |
| Fetal Bovine Serum-ES cell qualified | Life Technologies | 10439 |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828010 |
| 2-mercaptoethanol 1000X | Life Technologies | 21985023 |
| Non Essential Amino Acid | Life Technologies | 11140050 |
| Stempro Accutase | Life Technologies | A1110501 |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 |
| 0.25% Trypsin- EDTA solution | Life Technologies | 25200-056 |
| Geltrex | Life Technologies | 12760-013 |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Millipore | SCM075 |
| SMC4 reagent | BD | 354357 |
| Neomycin resistant MEF | Millipore | PMEF-NL |
| Hygromycin resistant MEF | Millipore | PMEF-HL |
| G418 (Geneticin) | LifeTechnologies | 11811 |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687010 |
| FIAU (Fialuridine, 1-2-Deoxy-2-fluoro-ß-D-arabinofuranosyl-5-iodouracil | Moravek Biochemicals and Radiochemicals | M251 |
| Electroporator: Gene Pulser Xcell | Bio-Rad | |
| 0.4 cm electroporation cuvette | Bio-Rad | 165-2088 |
| DIG-High prime DNA labeling and detection starter kit II | Roche | 11585614910 |
| Hybridization denature solution | VWR | 82021-478 |
| PCR DIG probe synthesis kit | Roche | 11636090910 |
| DIG wash set | Roche | 11585762001 |
| Anti-Digoxigenin (DIG-AP) | Roche | 11093274910 |
| CSPD chemiluminescence system | Roche | 11755633001 |
| DIG wash and block buffer set | Roche | 11585762001 |
| 50X TAE buffer | Life Technologies | 24710030 |
| Blotting buffer (25 mM Tris pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.1% Tween20) | ||
| Hoefer Ultraviolet Crosslinker | Fisher Scientific | 03-500-308 |
| Spermidine | Fisher | AC13274-0010 |
| Tris HCl 2M ( pH 7.5 ) | VWR | 200064-506 |
| Denville Scientific blue bio film 8×10 | Fisher | nc9550782 |
| DNA molecular weight marker II ( DIG-labeled ) | Roche | 11218590910 |
| Amersham Blotting membrane Hybond-N+ | Roche | 95038-400 |
| Pyrex glass drying tray | Fisher | 15-242A |
| Kimberly-Clark C-fold paper towels | Fisher | 06-666-32B |
| Whatman 3MM paper ( 26X41) | Fisher | 05-713-336 |
| Hybridization bag | Roche | 11666649001 |
| Hybridization tubes | Fisher | 13-247-300 |
| Hybridization oven rotisserie Shake 'n' Stack | Fisher | HBMSOV14110 |
References
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature. 31, 227-229 (2013).
- Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nat Methods. , (2013).
- DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Res. 41, 4336-4343 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
- Anders, C., Niewoehner, O., Duerst, A., Jinek, M. Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease. Nature. 513, 569-573 (2014).
- Deltcheva, E., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471, 602-607 (2011).
- Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E2579-E2586 (2012).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, e00471 (2013).
- Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31, 822-826 (2013).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31, 827-832 (2013).
- Mali, P., et al. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nature Biotechnology. 31, 833-838 (2013).
- Pattanayak, V., et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nature Biotechnology. 31, 839-843 (2013).
- Shen, B., et al. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nature Methods. 11, 399-402 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9, 1956-1968 (2014).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
- Szymczak, A. L., et al. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single ‘self-cleaving’ 2A peptide-based retroviral vector. Nature Biotechnology. 22, 589-594 (2004).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 157-162 (2009).
- Yagi, T., et al. A novel negative selection for homologous recombinants using diphtheria toxin A fragment gene. Analytical Biochemistry. 214, 77-86 (1993).
- Wu, S., Ying, G., Wu, Q., Capecchi, M. R. A protocol for constructing gene targeting vectors: generating knockout mice for the cadherin family and beyond. Nature Protocols. 3, 1056-1076 (2008).
- Xue, H., et al. A targeted neuroglial reporter line generated by homologous recombination in human embryonic stem cells. Stem Cells. 27, 1836-1846 (2009).
- Liu, Y., Jiang, P., Deng, W. OLIG gene targeting in human pluripotent stem cells for motor neuron and oligodendrocyte differentiation. Nature Protocols. 6, 640-655 (2011).
