Effiziente Erzeugung von hiPSC Neural Lineage Spezifische Knockin Reporter Mit den CRISPR / Cas9 und Cas9 Doppel Nickase-System

CRISPR (Clustered regelmäßig beabstandet Short Palindromic Repeats) / CAS (CRISPR-assoziierten) System, zusammen mit anderen Genom-Editing-Tools, hat das menschliche Genom Manipulation in den letzten Jahren ^1-7 revolutioniert. Hauptkomponenten in der CRISPR / Cas9 System sind einzelne Führungs RNA (sgRNA) und Cas9. Cas9 ist ein RNA-geführten Typ-II-DNA-Endonuklease. Es hat zwei Nuklease Domänen HNH und RuvC, die neben einer protospacer benachbarten Motiv für die Herstellung von DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) zu einem bestimmten genomischen Region verantwortlich sind (PAM) ^7-10 .Ein sgRNA hat eine kombinierte Funktion derjenigen crRNA und tracrRNA, zwei adaptive in Bakterien (wie Streptococcus pyogenes) und Archaeen identifiziert Immunität RNA-Moleküle, gegen DNA Invasion von exogenen Quellen ^9-11 kämpfen. Bei entsprechend gestalteten und auf Säugerzellen co-eingeführt erkennt der sgRNA die PAM-Sequenz, Basenpaare mit dem komplementären Strang der Ziel-DNA, und Führungen und transaktiviert Cas9 abzuspaltenan beiden DNA-Stränge unmittelbar stromauf von PAM ^7. Anschließend homologen Rekombination (HDR, in Gegenwart eines Targeting-Vektors) oder nicht-homologen Endverbindung (NHEJ) auftreten wird, um die Doppelstrangbrüche zu reparieren. Transgene, wie beispielsweise cDNAs, Reporterkassetten oder Antibiotika-resistente Fragmente können integriert werden, und transgene oder knockin Linien.

Obwohl die CRISPR / Cas9 System ist sehr effizient und relativ spezifisch, unerwünschte Off-Target Aktivitäten wurden berichtet ^12-15. Um Off-Target-Ereignisse zu minimieren, haben Cas9 nickases (Cas9n) auch ausgeführt worden, ^{9,10,14,16,17.} Cas9n (Cas9 D10A oder Cas9 H840A) ist Cas9 Enzym mit Mutationen in einem der zwei Nuklease Domänen, die nur löst eine nick an einem DNA-Strang. Zur Spaltung an beiden Strängen zu erzielen, werden zwei sgRNAs gestaltet, um ein Paar nickases, die separat an den nahe gelegenen Orte der zwei verschiedenen DNA-Stränge schneidet führen. Die "Doppel Nicking" Strategie erfordert eine more strengen Design als die herkömmliche Cas9 Plattform und bietet sowohl eine hohe Effizienz und eine hohe Spezifität für die Gen-Bearbeitungs Experimenten.

Diese Handschrift beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von linienspezifischen menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) Reporter mit CRISPR / Cas-System unterstützt die homologe Rekombination. Schritte zur Erlangung der erforderlichen Komponenten für die Herstellung von neuralen Abstammung Reporter Linien mit dem CRISPR / System vermittelt Cas Genom Bearbeitung beschrieben, mit einem Fokus auf Bau von Targeting-Vektoren und sgRNAs. Dieses Protokoll wurde erfolgreich in mehreren hiPSC Leitungen einschließlich von gesunden Personen und von Patienten mit Erkrankungen des ZNS abgeleitet wiederholt. Gene, die in unserem Labor gezielt gehören OLIG2, HB9 (MNX1), NEUROG2, SOX1, ALDH1L1 und SOD1. Targeting-Effizienz von CRISPR / Cas System vermittelte homologe Rekombination in hiPSCs im Bereich von 20-40%, was mit früheren Berichten ^1,18,19 ist. Im Vergleich zu einem typical Effizienz von 1-2% in konventionellen Gen-Targeting-Experimente wird das Targeting-Effizienz deutlich verbessert.