משלוח<em> In vivo</em> חריפה לסירוגין היפוקסיה בילוד מכרסמים לתא תרבויות עצבית אב נגזרות אזור ראש Subventricular
Summary
מאמר זה מתאר את המתודולוגיה לניהול תקופות קצרות של היפוקסיה לסירוגין לגורי עכבר או עכברוש לאחר לידה היום 1-8. גישה זו ביעילות מעוררת רמה חזקה רקמה "תחול השפעה" על תאים עצביים בתרבית שנקצרים בתוך 30 דקות של חשיפת היפוקסיה.
Abstract
Extended culture of neural stem/progenitor cells facilitates in vitro analyses to understand their biology while enabling expansion of cell populations to adequate numbers prior to transplantation. Identifying approaches to refine this process, to augment the production of all CNS cell types (i.e., neurons), and to possibly contribute to therapeutic cell therapy protocols is a high research priority. This report describes an easily applied in vivo “pre-conditioning” stimulus which can be delivered to awake, non-anesthetized animals. Thus, it is a non-invasive and non-stressful procedure. Specifically described are the procedures for exposing mouse or rat pups (aged postnatal day 1-8) to a brief (40-80 min) period of intermittent hypoxia (AIH). The procedures included in this video protocol include calibration of the whole-body plethysmography chamber in which pups are placed during AIH and the technical details of AIH exposure. The efficacy of this approach to elicit tissue-level changes in the awake animal is demonstrated through the enhancement of subsequent in vitro expansion and neuronal differentiation in cells harvested from the subventricular zone (SVZ). These results support the notion that tissue level changes across multiple systems could be observed following AIH, and support the continued optimization and establishment of AIH as a priming or conditioning modality for therapeutic cell populations.
Introduction
מטרתה של שיטה זו היא reproducibly וביעילות כדי לספק התקפים לסירוגין של חמצן סביבה הורידה מערכתי למכרסמים בילוד. הרציונל לשימוש בהיפוקסיה לסירוגין (IH) כדי לתפעל ביולוגיה של תא גזע מקורו בניסויים בתרביות תאים במבחנה שבי O 2 תוכן של תקשורת הצמיחה משתנה. באופן ספציפי, בהשוואה לתנאים "רגילים" של 20% O 2, תרבות המורחבת של תאי אוכלוסיות תאי גזע / אב ב2 תוצאות O 3% בהתפשטות מוגברת, ירידה באפופטוזיס וגדל 1,2 תשואה עצבי.
קבוצה זו יש לו ניסיון משמעותי עם הממשל של IH המערכתי, ובצעה מחקרים מקיפים על עצם את התפקיד של IH בפלסטיות הנשימה 3-7. עבודה זו, והממצא האחרון שIH הכרוני מוגבר neurogenesis במכרסמים במערכת העצבים המרכזית 8-10, מהווים את הבסיס לחקירה של חריף in vivoהיפוקסיה כגירוי נפשית מראש (כלומר., לפני קציר רקמות) על התרבות הבאה של תאי גזע עצביים / אב (NPCs) 11. למרבה הפלא, כאשר גורי עכבר נחשפו לתקופה (<1 שעה) של היפוקסיה לסירוגין חריפה (AIH) קצרה, תאים שנקצרו מאזור subventricular (SVZ) שגדלו באופן משמעותי את היכולת להרחבה כneurospheres או תאי monolayer חסיד. פרוטוקול AIH היה קשור גם עם ביטוי מוגבר של גורם "גורל עצבי" שעתוק (Pax6).
בהתאם לכך, בvivo פרוטוקולי AIH עשויים לספק אמצעים לNPCs לפני "ראש" התרבות. לדוגמא, יישומים לגישה זו יכולים לכלול הרחבת אוכלוסיות תאים לפני ההשתלה לתוך מערכת העצבים המרכזית נפצעה, או פשוט להגדיל את הבידול העצבי של תאים בתרבית לפני ניסויים במבחנה. יתר על כן, בגלל זה הוא משלוח מערכתי, כלאיבר, רקמה או תא הוא מועמד למחקר דומה. לכן, כפי שנכתב בפרוטוקול הוא פוטנציאל ישים למגוון רחב של מחקרים על מניפולציה חמצן לסירוגין ביונקים קטנים.
ישנם יתרונות מסוימים לגישה זו. בעבודה שפורסמה אחרת, טופלו ילודים כהמלטה עם הסכר בתאי hypobaric, המאפשר למינון כרוני, פחות טיפול לפני הטיפול, ושמרו על קשר אימהי במהלך טיפול 9. הגישה הנוכחית עוקפת טיפולים חוזרים ונשנים לנקבת רבייה, או שימוש בסכר שונה עבור כל ניסוי. פרוטוקול זה גם מאפשר מחקר של ילודים בהתאמה המלטה וגיל בהתאמה מדויקים. נציגי נתונים להפגין את כוח עיקרי נוסף של פרוטוקול זה, כלומר המהירות שבה AIH, כפי שנמסר, מעורר תגובה ביולוגית חזקה ועקבית בביולוגיה של תא גזע עצבי. זה קובע תקדים לפרוטוקול זה כדי לעורר Biologi הדקיק וברמה-הסלולריתשינויי קאל שמשנים ביולוגיה של תא.
דו"ח זה מתאר את הנהלים מפורטים המשמשים לחשיפת גורי מכרסמים לAIH כמו גם ניתוח האוכלוסייה של תאי SVZ גדל כמו neurospheres.
Protocol
Representative Results
Discussion
This work reports the development of a protocol to expose neonatal rodents to AIH. The parameters described here effectively alter in situ neural stem cell biology, which is observable over several rounds of cell passage. Specifically, AIH increases the number of non-adherent neurospheres, the expansion of cells within each neurosphere (refected by sphere diameter), the expansion of adherent NPC populations, and the presence of neuroblasts in both non-adherent and adherent populations. It should be emph…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding sources responsible for this work: 5K12HD055929 (HHR), 5R01NS080180-02 (DDF).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Mouse plethysmography chambers | Buxco | PLY4211 | |
| Flow meter | Porter | F150 | |
| Bias flow unit | AFPS | ||
| Baseline Gas Mix | Airgas | AIZ300 | Compressed Air |
| Hypoxic Gas Mix | Airgas | X03NI72C2000189 | 10% Oxygen, balance nitrogen |
| Oxygen Meter | Teledyne | AX-300 |
References
- Studer, L., et al. Enhanced proliferation, survival, and dopaminergic differentiation of CNS precursors in lowered oxygen. J Neurosci. 20 (19), 7377-7383 (2000).
- Chen, H. L., et al. Oxygen tension regulates survival and fate of mouse central nervous system precursors at multiple levels. Stem Cells. 25 (9), 2291-2301 (2007).
- Ling, L., et al. Chronic intermittent hypoxia elicits serotonin-dependent plasticity in the central neural control of breathing. J Neurosci. 21 (14), 5381-5388 (2001).
- Mitchell, G. S., et al. Invited review: Intermittent hypoxia and respiratory plasticity. J Appl Physiol. 90 (6), 2466-2475 (2001).
- Fuller, D. D., Zabka, A. G., Baker, T. L., Mitchell, G. S. Phrenic long-term facilitation requires 5-HT receptor activation during but not following episodic hypoxia. J Appl Physiol. 90 (5), 2001-2006 (2001).
- Fuller, D. D., Johnson, S. M., Olson, E. B., Mitchell, G. S. Synaptic pathways to phrenic motoneurons are enhanced by chronic intermittent hypoxia after cervical spinal cord injury. J Neurosci. 23 (7), 2993-3000 (2003).
- Baker-Herman, T. L., et al. BDNF is necessary and sufficient for spinal respiratory plasticity following intermittent hypoxia. Nat Neurosci. 7 (1), 48-55 (2004).
- Zhu, L. L., et al. Neurogenesis in the adult rat brain after intermittent hypoxia. Brain Res. 1055, 1-6 (2005).
- Zhang, J. X., Chen, X. Q., Du, J. Z., Chen, Q. M., Zhu, C. Y. Neonatal exposure to intermittent hypoxia enhances mice performance in water maze and 8-arm radial maze tasks. Journal of neurobiology. 65 (1), 72-84 (2005).
- Zhu, L. L., Wu, L. Y., Yew, D. T., Fan, M. Effects of hypoxia on the proliferation and differentiation of NSCs. Mol Neurobiol. 31 (1-3), 231-242 (2005).
- Ross, H. H., et al. In vivo intermittent hypoxia elicits enhanced expansion and neuronal differentiation in cultured neural progenitors. Exp Neurol. 235 (1), 238-245 (2012).
- Fuller, D. D., et al. Induced recovery of hypoxic phrenic responses in adult rats exposed to hyperoxia for the first month of life. J Physiol. 536 (Pt 3), 917-926 (2001).
- Fuller, D. D., Fregosi, R. F. Fatiguing contractions of tongue protrudor and retractor muscles: influence of systemic hypoxia. J Appl Physiol. 88 (6), 2123-2130 (2000).
- Baker, T. L., Fuller, D. D., Zabka, A. G., Mitchell, G. S. Respiratory plasticity: differential actions of continuous and episodic hypoxia and hypercapnia. Respir Physiol. 129 (1-2), 25-35 (2001).
- Marshall, G. P., et al. Production of neurospheres from CNS tissue. Methods Mol Biol. 438, 135-150 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (45), (2010).
