Etiquetado Dual De Las Células De La Cresta Neural Y Los Vasos Sanguíneos Dentro De Los Embriones De Pollo Usando Chick^GFP Injerto De Tubo Neural Y Carbocianina Tinte DiI Inyección

1. Preparación de micro-bisturí para ablaciones de tubo neural Dé forma a un micro-bisturí de una aguja de coser de acero disponible en el comercio. Primero aplane la aguja en ambos lados usando una muela montada en una amoladora de banco motorada. Comience a dar forma al bisturí, primero en una piedra de Arkansas de grado grueso usando un movimiento circular controlado, en direcciones alternativas, a ambos lados de la aguja. Continúe con los mismos movimientos de afilado en una piedra de Arkansas de grado extra fino para dar forma a un micro-bisturí ultra fino, con un borde de corte bien definido (Figura 1A, B).NOTA: Las alternativas al micro-bisturí podrían ser agujas afiladas electrolímicamente, agujas de tungsteno disponibles en el mercado o agujas de vidrio tiradas. 2. Incubar huevos de tipo salvaje y GFP a la etapa deseada Almacene los huevos de gallina fertilizados y los huevos de gallina transgénicos de GFP en una incubadora enfriada a 14 – 15 ° C antes de la incubación, ya que el desarrollo se detiene a esta temperatura. Guarde los huevos durante unos días, hasta una semana. Para comenzar el desarrollo, coloque los huevos de tipo salvaje y GFP en una bandeja horizontalmente e incube simultáneamente en un humidificado (58 – 60%) incubadora a 37,5 ºC, de modo que los embriones se encuentran en etapas coincidentes para el injerto de tubo neural. Para obtener embriones en la etapa de desarrollo de 10 – 12 somitas para llevar a cabo injertos de tubo neural vagal, incubar óvulos durante 1,5 días (33 – 38 hrs) y en etapa embriones de acuerdo con las tablas de desarrollo de Hamburger y Hamilton21. 3. Preparar huevos para ventanas e injertos Mueva un huevo a la vez a un soporte de huevo hecho a medida para las ventanas. Haga un pequeño agujero en la cáscara del huevo tocando repetidamente, con tijeras rectas, en la superficie superior del extremo puntiagudo del huevo. Retire 2 – 3 ml de albúmina del huevo con una aguja hipodérmica de 181/2 G y una jeringa de 5 ml. La eliminación de la albúmina baja la yema dentro del huevo y facilita las ventanas posteriores sin causar ningún daño al embrión. Deseche la albúmina. Selle el agujero con una pequeña tira de cinta transparente cortada a su tamaño con tijeras finas. Usando tijeras curvas, toque otro agujero en la superficie superior de la cáscara del huevo. Inserte la punta de las tijeras en el agujero y, manteniendo las tijeras paralelas al banco, trabaje en un movimiento circular para cortar una ventana de ~ 2 cm de diámetro en la parte superior de la cáscara. Mantenga las tijeras en una posición estacionaria y gire el huevo. Deseche el disco eliminado de la cáscara del huevo. En E1.5, el embrión es reconocible como un disco amarillo más oscuro en la parte superior de la yema. Retire cualquier residuo de cáscara que haya caído dentro del huevo usando pinzas. Deseche cualquier huevo no fertilizado (identificado por una pequeña mancha blanca en la parte superior de la yema de color amarillo claro). 4. Preparar el embrión huésped para recibir tejido injertado Ajuste el microscopio estéreo al nivel de los ojos y optimice la orientación de la fuente de luz de cuello de cisne para iluminar adecuadamente el embrión sin causar reflejos. Para visualizar el embrión propiamente dicho,inyecte una pequeña cantidad de tinta india bajo el centro del disco amarillo más oscuro, utilizando un tubo bucal y una micro-pipeta de vidrio tirado(Figura 1C, Oii). Preparar la tinta 50:50 con PBS que contenga Penicilina/Estreptomicina a 100 μg/ml de concentración final. Inserte la micro-pipeta a través de la membrana de la yema fuera del perímetro del blastodermo y luego ángulo cuidadosamente su punta directamente debajo del embrión. Entregue tinta debajo del embrión soplando en el tubo de la boca. Si no se permite el pipeteo bucal, use una jeringa de 1 ml en su lugar. Tenga cuidado de no introducir burbujas de aire debajo del embrión, lo que puede conducir a la contaminación, luego retire cuidadosamente la micro-pipeta de vidrio. Este es un paso delicado que puede conducir a la muerte del embrión si no se hace con precisión. Escenificar el embrión por referencia a Hamburger y Hamilton21 y registrar el escenario en un libro de laboratorio. Usando un micro-bisturí hecho a medida (o una aguja de tungsteno fina) montado en un soporte de aguja, haga un jadeo muy pequeño en la membrana vitelina, junto al área donde se realizará la microcirugía. Aplique cuidadosamente de 2 a 3 gotas de PBS sobre el desgarro de la membrana (usando una micro-pipeta de vidrio y el tubo bucal) para crear espacio entre el embrión y la membrana. Corte una ventana más grande en la membrana para exponer toda la región donde se llevará a cabo la microcirugía. Retire la región del tubo neural de interés usando el micro-bisturí, comenzando con incisiones transversales rostrales y caudales en todo el tubo neural dorsal (a nivel de somita 1 a 7 en el video). Corte bilateralmente entre el tubo neural y los somitas para separar el tubo neural de los tejidos circundantes, sin dañar los somitas. Separe muy suavemente el tubo neural de la notocorda subyacente, que debe permanecer intacta. Tenga en cuenta que la escisión exitosa del tubo neural dejará todos los tejidos circundantes perfectamente intactos (Figura 2). Retire el tubo neural extirpado aspirando en una micro-pipeta de vidrio y, a continuación, deséchelo. Registre el nivel de ablación del tubo neural en un libro de laboratorio. El embrión huésped ya está listo para recibir el tubo neural del donante. 5. Preparar el tejido de injerto del donante Seleccione un embrión GFP con ventanas y adaptado al escenario visualizando bajo un microscopio estéreo fluorescente con filtro FITC. La fluorescencia GFP hace que sea muy fácil visualizar los somitas y estadificar el embrión. Una vez que se ha identificado un embrión emparejado con la etapa, retire el embrión del óvulo haciendo 4 incisiones, con tijeras de resorte Pascheff-Wolff(Figura 1C, l)en forma de rectángulo alrededor del embrión y luego recogerlo suavemente con una cuchara de embrión. Coloque el embrión en un vidrio de reloj cuadrado con una base de polímero de sigard. Agite suavemente el embrión con dumont #5 pinzas para eliminar cualquier yema adherida. Retire la membrana de vitelina y fije el embrión sobre la base del polímero utilizando pasadores de minucias inoxidables (Figura 1C). Usando las tijeras de resorte, haga 4 incisiones en forma rectangular alrededor del tubo neural y los somitas circundantes, en la misma región que se ha eliminado del embrión huésped. Usando una pipeta de transferencia de plástico, transfiera el tubo neural y los tejidos de somita del embrión de GFP donante a un vidrio de reloj que contenga pancreatina al 0,2% en PBS de pluma /estreptococo. Permita que la digestión enzimática proceda durante 10 minutos en RT para ayudar a separar los tejidos. Después de la incubación en enzima, use pasadores de minucias inoxidables montados en un mango para separar manualmente el tubo neural de todos los tejidos adyacentes. Usando una micro-pipeta de vidrio, transfiera el tubo neural disociado a otro vidrio de reloj que contenga DMEM + 10% de suero(por ejemplo,cabra, caballo o ternero fetal) sobre hielo, para enjuagar el exceso de pancreatina y detener la digestión enzimática. Después de 5 min, el tubo neural diseccionado está listo para ser injertado ortotópicamente en el huésped del polluelo(Figura 2 y S1). 6. Injertar el tejido Usando una micro-pipeta de vidrio, transfiera cuidadosamente el tubo neural diseccionado desde el vidrio del reloj al embrión huésped. Coloque el tubo neural en la orientación anterior-posterior correcta y empuje suavemente el explant adyacente a la región extirpada del huésped del polluelo usando el micro-bisturí. Deje un pequeño fragmento de ectodermo unido a, o cortando un pequeño nick en, la superficie dorsal para identificar la orientación del tubo neural. Si es necesario, use el micro-bisturí para recortar el explant al tamaño exacto de la región extirpada. Guíe suavemente el tubo neural hacia la región ablacional y colóquelo de tal manera que el lado dorsal esté correctamente orientado. Use una micro-pipeta de vidrio, montada en un tubo bucal, para eliminar el PBS y/o el líquido que rodea el injerto. Esto ayuda a que los tejidos del donante y del huésped se adhieran y que el injerto se establezca. Selle toda la ventana con cinta transparente de 24 mm de ancho para evitar la deshidratación y la contaminación. Etiquete el embrión quimérico marcando con un lápiz en la cáscara de huevo y registre su número en el libro de laboratorio. Devuelva el huevo a la incubadora para su posterior desarrollo. 7. Inyectar DiI en los vasos sanguíneos del embrión huésped En el punto de tiempo experimental deseado (aquí, 3 – 10 días después), recupere el embrión quimérico de la incubadora y retire la cinta transparente usando tijeras rectas para obtener acceso al embrión dentro del huevo. Si es necesario, amplíe la ventana en la cáscara usando las tijeras. Tenga cuidado de no dañar la membrana corioalantólica si está unida a la cáscara, lo que resultaría en hemorragia y pondría en peligro el etiquetado de los vasos sanguíneos. Elija una vena accesible en la yema asegurándose de que el flujo sanguíneo se dirija hacia el embrión. Elija un punto de ramificación de una de las venas vitelinas (Figura 3B, C).NOTA: En E6.5 – E7.5, la membrana corioalantólica puede necesitar ser movida suavemente a un lado con pinzas para acceder a las venas de la yema. Después de E8.5, la única opción es inyectar en una de las venas de la membrana coriorantoica ya que, en esta etapa, la membrana corioalantórica cubre completamente el embrión. Retire la membrana vitelina por encima del punto de inyección elegido con dos pinzas Dumont #5 desgarrando en direcciones opuestas. Rompa una aguja de vidrio tirada usando un #5 Dumont y ajuste su diámetro al tamaño aproximado de la vena antes de cargar con CellTracker CM-DiI. Hacer la solución de diI a 40 μg/μl en DMSO y almacenar a -20 °C. Preparar la solución de trabajo en sacarosa/PBS a 0,3 M a una concentración de 4 μg/μl. Aspirar entre 5 – 10 μl de DiI en sacarosa/PBS de 0,3 M en la aguja usando la succión con un tubo bucal. Los embriones más antiguos pueden requerir hasta 25 μl o más. A partir de E8.5, los embriones tienen venas más grandes y musculosas, que pueden necesitar mantenerse en posición con un #5 De Dumont antes de apuñalar con la aguja de vidrio cargada de DiI. Inserte rápidamente la aguja en la vena y sople constantemente con el tubo bucal para permitir que el DiI se una al flujo sanguíneo lentamente sin formar un coágulo. Alternativamente, utilice un inyector de presión para la administración de DiI. 8. Cosecha de embriones para seccionamiento o examen de montaje completo Para retener tanto DiI dentro del embrión como sea posible, coseche el embrión inmediatamente después de la inyección sacándolo en una cuchara perforada y cortando los vasos sanguíneos y los tejidos conectivos con un par de tijeras rectas, para liberar el embrión de la yema. Retire las membranas sueltas y diseccionar los órganos de interés(es decir,los pulmones y el tracto digestivo en este tutorial), teniendo mucho cuidado de no comprimir el tejido, lo que crea difusión del DiI. Fijar inmediatamente los tejidos por inmersión en 4% PFA durante 1 – 2 horas en RT. Enjuague el tejido durante 5 min en PBS, luego 15 min en PBS que contenga 5 μg/ml dapi. Monte las muestras en un portaobjetos de microscopio puenteado para el examen de montaje completo o incruste para la criosección.