Rotulagem dupla de células de crista neural e vasos sanguíneos dentro de embriões de frango usando enxerto de tubo neural chick^GFP e injeção de dii de corante de carbocyanina

1. Preparação de Micro-bisturi para ablações de tubos neurais Modele um micro-bisturi a partir de uma agulha de costura de aço comercialmente disponível. Primeiro achate a agulha em ambos os lados usando uma roda de moagem montada em um moedor de banco alimentado. Comece a moldar o bisturi, primeiro em uma pedra grosseira do Arkansas usando um movimento circular controlado, em direções alternativas, em ambos os lados da agulha. Continue os mesmos movimentos de afiação em uma pedra arkansas de grau extra fino para moldar um micro-bisturi ultra fino, com uma borda de corte bem definida(Figura 1A, B).NOTA: Alternativas ao micro-bisturi podem ser agulhas eletroliticamente afiadas, agulhas de tungstênio comercialmente disponíveis ou agulhas de vidro puxadas. 2. Incubar ovos selvagens e gfp para o estágio desejado Armazene ovos de galinha fertilizados e ovos de galinha GFP transgênicos em uma incubadora resfriada a 14 – 15 °C antes da incubação à medida que o desenvolvimento é interrompido a esta temperatura. Guarde ovos por alguns dias, até uma semana. Para iniciar o desenvolvimento, coloque ovos de tipo selvagem e GFP em uma bandeja horizontalmente e incubar simultaneamente em umidificado (58 – 60%) incubadora a 37,5 ºC, de modo que os embriões estão em estágios correspondentes para enxerto de tubo neural. Para obter embriões no estágio de desenvolvimento de 10 a 12 somites para a realização do enxerto de tubo neural vagal, incubar ovos por 1,5 dias (33 – 38 horas) e embriões de estágio de acordo com as tabelas de desenvolvimento de Hamburger e Hamilton21. 3. Prepare ovos para janelas e enxertos Mova um ovo de cada vez para um suporte de ovos feito sob medida para janelas. Faça um pequeno furo na casca do ovo batendo repetidamente, com uma tesoura reta, na superfície superior da extremidade pontiaguda do ovo. Remova 2 – 3 ml de albumina do ovo com uma agulha hipodérmica de 181/2 G e 5 ml de seringa. A remoção da albumina abaixa a gema dentro do ovo e facilita a janela subsequente sem causar qualquer dano ao embrião. Descarte a albumina. Sele o orifício com uma pequena tira de fita clara cortada em tamanho com uma tesoura fina. Usando uma tesoura curva, bata outro orifício na superfície superior da casca do ovo. Insira a ponta da tesoura no orifício e, mantendo a tesoura paralela ao banco, trabalhe em um movimento circular para cortar uma janela de ~2 cm de diâmetro em cima da concha. Mantenha a tesoura em posição estacionária e gire o ovo. Descarte o disco removido da casca de ovo. Em E1.5, o embrião é reconhecível como um disco amarelo mais escuro em cima da gema. Remova os detritos da casca que caíram dentro do ovo usando pinças. Descarte quaisquer ovos não fertilizados (identificados por uma pequena mancha branca em cima da gema amarela clara). 4. Prepare o embrião hospedeiro para receber tecido enxertado Ajuste o microscópio estéreo ao nível dos olhos e otimize a orientação da fonte de luz gooseneck para iluminar adequadamente o embrião sem causar reflexos. Para visualizar o embrião propriamente dito,injete uma pequena quantidade de tinta indiana sob o centro do disco amarelo mais escuro, usando um tubo bucal e uma micro-pipeta de vidro puxado(Figura 1C, Oii). Prepare a tinta 50:50 com PBS contendo Penicilina/Estreptomicina a 100 μg/ml de concentração final. Insira a micro-pipeta através da membrana da gema fora do perímetro da blastoderm e, em seguida, angeta cuidadosamente sua ponta diretamente abaixo do embrião. Entregue tinta debaixo do embrião soprando no tubo bucal. Se a pipetação bucal não for permitida, use uma seringa de 1 ml em vez disso. Tenha cuidado para não introduzir bolhas de ar sob o embrião, que pode levar à contaminação, em seguida, remova cuidadosamente a micro-pipeta de vidro. Este é um passo delicado que pode levar à morte do embrião se não for feito com precisão. Enseia o embrião por referência a Hamburger e Hamilton21 e grava o palco em um livro de laboratório. Usando um micro-bisturi feito sob medida (ou uma agulha de tungstênio fino) montado em um suporte de agulha, faça um corte muito pequeno na membrana vitelline, ao lado da área onde a microcirurgia será realizada. Aplique cuidadosamente 2 – 3 gotas de PBS sobre a ruptura da membrana (usando uma micro-pipeta de vidro e o tubo bucal) para criar espaço entre o embrião e a membrana. Corte uma janela maior na membrana para expor toda a região onde ocorrerá a microcirurgia. Remova a região de interesse do tubo neural usando o micro-bisturi, começando com incisões transversais rostral e caudal em todo o tubo neural dorsal (ao nível de somite 1 a 7 no vídeo). Corte bilateralmente entre o tubo neural e os somitas para separar o tubo neural dos tecidos circundantes, sem danificar os somites. Muito gentilmente separe o tubo neural do notochord subjacente, que deve permanecer intacto. Note que a excisão do tubo neural bem sucedida deixará todos os tecidos circundantes perfeitamente intactos(Figura 2). Remova o tubo neural excisado aspirando-o em uma micro-pipeta de vidro, em seguida, descarte. Regisso nível de ablação de tubo neural em um livro de laboratório. O embrião hospedeiro está pronto para receber o tubo neural do doador. 5. Prepare o tecido do enxerto de doador Selecione um embrião GFP com janelas e partidas de palco, visualizando sob um microscópio estéreo fluorescente com filtro FITC. A fluorescência GFP torna muito fácil visualizar os somites e encenar o embrião. Uma vez identificado um embrião compatível com o estágio, remova o embrião do ovo fazendo 4 incisões, com uma tesoura de mola Pascheff-Wolff(Figura 1C, l) em uma forma de retângulo ao redor do embrião e, em seguida, pegá-lo suavemente com uma colher de embrião. Coloque o embrião em um vidro de relógio quadrado com uma base de polímero sylgard. Agite suavemente o embrião com Dumont #5 pinças para remover qualquer gema presa. Remova a membrana vitelina e fixe o embrião na base do polímero usando pinos de minutien inoxidáveis(Figura 1C). Usando a Tesoura de Mola, faça 4 incisões em uma forma retangular ao redor do tubo neural e somitas circundantes, na mesma região que foi removida do embrião hospedeiro. Usando uma pipeta de transferência de plástico, transfira o tubo neural e os tecidos de somite do embrião GFP doador para um vidro de relógio contendo 0,2% de pancreatina em Pen/Strep PBS. Permita que a digestão enzimática prossiga por 10 minutos no RT para ajudar a separar os tecidos. Após a incubação em enzima, use pinos de minutien inoxidáveis montados em uma alça para separar manualmente o tubo neural de todos os tecidos adjacentes. Usando uma micro-pipeta de vidro, transfira o tubo neural dissociado para outro vidro de relógio contendo DMEM + 10% de soro (por exemplo,cabra, cavalo ou bezerro fetal) no gelo, para enxaguar o excesso de pancreatina e parar a digestão enzimática. Após 5 min, o tubo neural dissecado está pronto para ser enxertado ortotopicamente no hospedeiro filhote(Figura 2 e S1). 6. Enxertar o tecido Usando uma micro-pipeta de vidro, transfira cuidadosamente o tubo neural dissecado do vidro do relógio para o embrião hospedeiro. Posicione o tubo neural na orientação anterior-posterior correta e empurre suavemente a explanta adjacente à região excisada do hospedeiro do filhote usando o micro-bisturi. Deixe um pequeno fragmento de ectoderme ligado, ou cortando um pequeno corte na superfície dorsal para identificar a orientação do tubo neural. Se necessário, use o micro-bisturi para aparar a explanta ao tamanho exato da região excisada. Guie suavemente o tubo neural para a região ablada e posicione-o de tal forma que o lado dorsal seja corretamente orientado. Use uma micro-pipeta de vidro, montada em um tubo bucal, para remover PBS e/ou fluido ao redor do enxerto. Isso ajuda o doador e os tecidos de acolhimento a aderir e o enxerto a se estabelecer. Sele toda a janela com fita clara de 24 mm de largura para evitar desidratação e contaminação. Rotule o embrião quimérico marcando com um lápis na casca de ovo e grave seu número no livro de laboratório. Devolva o ovo à incubadora para maior desenvolvimento. 7. Injete DII em vasos sanguíneos de embrião hospedeiro No ponto de tempo experimental desejado (aqui, 3 – 10 dias depois), recupere o embrião quimérico da incubadora e remova a fita clara usando uma tesoura reta para ter acesso ao embrião dentro do ovo. Se necessário, amplie a janela da concha usando a tesoura. Tenha cuidado para não danificar a membrana corioallantónica se estiver presa à casca, o que resultaria em hemorragia e colocaria em risco a rotulagem dos vasos sanguíneos. Escolha uma veia acessível na gema certificando-se de que o fluxo sanguíneo seja direcionado para o embrião. Escolha um ponto de ramificação de uma das veias vitelline(Figura 3B, C).NOTA: Em E6.5 – E7.5, a membrana corioallantórica pode precisar ser suavemente movida de lado com pinças para acessar as veias da gema. Após o E8.5, a única opção é injetar em uma das veias de membrana corioallantóica, já que, por esta fase, a membrana corioallantóica cobre totalmente o embrião. Remova a membrana vitelline acima do ponto de injeção escolhido usando duas pinças Dumont #5 rasgando em direções opostas. Quebre uma agulha de vidro puxada usando um #5 Dumont e ajuste seu diâmetro para o tamanho aproximado da veia antes de carregar com CellTracker CM-DiI. Faça a solução de estoque DiI a 40 μg/μl em DMSO e armazene a -20 °C. Prepare a solução de trabalho em 0,3 M de sacarose/PBS a uma concentração de 4 μg/μl. Aspire entre 5 – 10 μl de DII em 0,3 M de sacarose/PBS na agulha usando sucção com um tubo bucal. Embriões mais velhos podem exigir até 25 μl ou mais. A partir de E8.5, os embriões têm veias maiores e mais musculares, que podem precisar ser mantidas em posição com um #5 Dumont antes de esfaquear com a agulha de vidro carregada de DII. Insira rapidamente a agulha na veia e sopre constantemente com o tubo bucal para permitir que o DII se junte ao fluxo sanguíneo lentamente sem formar um coágulo. Alternativamente, use um injetor de pressão para a entrega de DII. 8. Colher embriões para secção ou exame de integral Para reter o máximo de DII dentro do embrião possível, colde o embrião imediatamente após a injeção, recolhendo-o em uma colher perfurada e cortando os vasos sanguíneos e tecidos conjuntivos com um par de tesouras retas, para libertar o embrião da gema. Remova quaisquer membranas soltas e disseque os órgãos de interesse (ou seja,os pulmões e o trato digestivo neste tutorial), tomando muito cuidado para não comprimir o tecido, o que cria difusão do DII. Fixar imediatamente os tecidos por imersão em 4% pfa por 1 – 2 horas na RT. Enxágüe o tecido por 5 min em PBS, depois 15 min em PBS contendo 5 μg/ml DAPI. Monte as amostras em um slide de microscópio ponte para exame de montagem inteiro ou incorpore-as para seção criobiósa.