鶏の胚内の神経堤細胞と血管の二重標識は、ひよこ^GFP 神経管移植とカルボシアニンDyI注射を用いた

1. 神経管アブレーションのためのマイクロメスの調製 市販のスチール製縫製針からマイクロメスを形作ります。 まず、パワードベンチグラインダーに取り付けられた粉砕ホイールを使用して、両側の針を平らにします。 メスの成形を開始し、最初に制御された円形の動きを使用して粗いグレードのアーカンソー石で、針の両側に交互に形成します。 非常に細かいグレードのアーカンソー石に同じ研ぎの動きを持って、細かく定義された最先端を持つ超微細なマイクロメスを形作ります(図1A、B)。注:マイクロメスの代替は、電解的に研いだ針、市販のタングステン針、または引っ張られたガラス針である可能性があります。 2. 野生型とGFP卵を所望のステージにインキュベート 受精鶏卵とトランスジェニックGFP鶏卵を、この温度で発生が停止するため、インキュベーション前に14〜15°Cの冷却インキュベーターに保存します。卵は数日間、最大1週間保存します。 開発を開始するには、野生のタイプとGFPの卵をトレイに水平に置き、加湿(58〜60%)で同時にインキュベートします。37.5 ºCのインキュベーターは、胚が神経管移植のための一致段階にあるように。 迷走神経管移植を行うための発達の10-12のスマイト段階で胚を得るために、ハンバーガーとハミルトン21の発達テーブルに従って1.5日間(33〜38時間)および胚をステージにインキュベートする。 3. 卵を窓と移植に備える 一度に1つの卵をカスタムメイドの卵ホルダーに移動して窓を付けます。卵の尖った端の上面に、まっすぐなはさみで繰り返しタッピングして、卵の殻に小さな穴を開けます。 卵から2〜3mlのアルブミンを181/2G皮下注射針と5mlの注射器で取り出します。アルブミンを取り除くことは卵の中の黄身を下げ、胚に損傷を与えることなく、その後の窓を容易にする。 アルブミンを捨てる。細かいはさみでサイズにカット透明テープの小さなストリップで穴をシールします。 湾曲したはさみを使用して、卵殻の上面に別の穴をタップします。はさみの先端を穴に入れ、ハサミをベンチに平行に保ち、シェルの上に直径約2cmの窓を切り取るために円形の動きで働きます。 はさみを静止した位置に保ち、卵を回転させます。卵殻の取り外したディスクを捨てます。E1.5では、胚は黄身の上に暗い黄色の円盤として認識可能である。 ピンセットを使用して卵の中に落ちた貝の破片を取り除きます。未受精卵を捨てる(それ以外の場合は薄い黄色の黄身の上に小さな白い斑点によって識別される)。 4. 移植された組織を受け取るために宿主胚を準備する ステレオ顕微鏡を目の高さに調整し、グースネック光源の向きを最適化して、反射を引き起こすことなく胚を適切に照らします。 適切な胚を視覚化するには、口管と引っ張られたガラスマイクロピペットを使用して、暗い黄色の円盤の中心の下に少量のインドのインクを注入する(図1C、Oii)。 ペニシリン/ストレプトマイシンを含むPBSで、インク50:50を100μg/mlの最終濃度で調製します。ブラトデアルムの周囲外の黄身膜を通してマイクロピペットを挿入し、慎重に胚の真下に先端を角度付けします。 口管に吹いて胚の下にインクを送ります。口のピペットが許可されていない場合は、代わりに1mlの注射器を使用してください。胚の下に気泡を入れて汚染を引き起こす可能性があり、ガラスのマイクロピペットを慎重に取り除かないように注意してください。これは、正確に行われなければ胚の死につながる微妙なステップです。 ハンバーガーとハミルトン21 を参照して胚をステージングし、ラボブックにステージを記録します。 針ホルダーに取り付けられたカスタムメイドのマイクロメス(または細かいタングステン針)を使用して、マイクロ手術が行われる領域の隣にあるビテリン膜に非常に小さなガッシュを作ります。 慎重に2〜3滴のPBSを膜の裂け目の上に塗布し(ガラスマイクロピペットと口管を使用して)胚と膜の間に空間を作り出す。膜内の大きな窓を切り、マイクロ手術が行われる領域全体を露出させます。 マイクロメスを使用して対象の神経管領域を除去し、下部神経管全体(ビデオ中のスマイト1〜7のレベル)全体にわたるロストラルと尾側横切り切開から始まる。 神経管とスマイトの間を両側で切断し、スマイトを損傷することなく、周囲の組織から神経管を分離する。 非常に穏やかに、そのまま残るはずの根底にある脊索から神経管を分離する。神経管切除が成功すると、周囲のすべての組織が完全にそのまま残されることに注意してください(図2)。 切除された神経管をガラスマイクロピペットに吸引して取り出し、捨てます。 ラボブックに神経管アブレーションのレベルを記録します。宿主胚はドナー神経管を受け取る準備が整いました。 5. ドナー移植組織の準備 FITCフィルターを使用した蛍光ステレオ顕微鏡での視視により、ウィンドウ付きのステージに適合したGFP胚を選択します。GFP蛍光は、スマイトを視覚化し、胚をステージすることが非常に容易になります。 ステージマッチの胚が同定されたら、4回の切開を行い、Pascheff-Wolffスプリングハサミ(図1C、l)を胚の周りの長方形の形で卵子から取り除き、胚スプーンでそっと拾います。 胚をシルガードポリマーベースの正方形の時計ガラスに入れます。デュモン#5ピンセットで卵子をそっと振り、付属の黄身を取り除きます。ビテリン膜を取り外し、ステンレスミヌティエンピンを使用して胚をポリマーベースに固定する(図1C)。 スプリングハサミを使用して、宿主胚から除去されたのと同じ領域で、神経管と周囲のスマイトの周りの長方形の形状で4切開を行う。 プラスチックトランスファーピペットを使用して、ドナーGFP胚からペン/ストレップPBSの0.2%膵臓を含むウォッチグラスに神経管とスマイト組織を移管する。 酵素消化をRTで10分間進め、組織を分離します。酵素中でインキュベーションした後、ハンドルに取り付けられたステンレスミヌティエンピンを使用して、隣接するすべての組織から手動で神経管を分離します。 ガラスマイクロピペットを使用して、DMEM + 10%血清(例えば、ヤギ、馬または胎児の子牛)を含む別の時計ガラスに解約した神経管を氷上で移し、余分な膵臓をすすぎ、酵素消化を止める。5分後、解剖された神経管は、チックホストに正交的に移植される準備ができている(図2およびS1)。 6. 組織の移植 ガラスマイクロピペットを使用して、解剖された神経管を時計ガラスから宿主胚に慎重に移す。神経管を正しい前後方方向に配置し、マイクロメスルを使用してひよこ宿主の切除領域に隣接する外植を静かに押す。神経管の向きを識別するために、小さなニックを取り付けたり、小さなニックを切断したりして、小さな外皮の断片を残します。 必要に応じて、切除物を切除領域の正確なサイズにトリミングするためにマイクロメスを使用します。 神経管をアブレート領域にそっと導き、後側が正しく向き合うよう位置づけます。口の管に取り付けられたガラスマイクロピペットを使用して、移植片を取り巻くPBSおよび/または流体を除去する。これは、ドナーおよび宿主組織が付着し、移植片が確立するのを助ける。 脱水や汚れを防ぐために、24 mm 幅のクリアテープで窓全体を密封します。 卵殻に鉛筆で印を付けてキメラ胚にラベルを付け、その数をラボブックに記録します。さらなる開発のためにインキュベーターに卵を返します。 7. 宿主胚の血管にDiIを注入する 所望の実験時点(ここでは、3〜10日後)で、培養器からキメラ胚を取り出し、まっすぐはさみを使用して透明なテープを取り出し、卵子内の胚にアクセスする。 必要に応じて、はさみを使用してシェル内のウィンドウを拡大します。絨毛膜がシェルに付着している場合は、出血を引き起こし、血管の標識を危険にさらす場合は、その絨毛膜を損傷しないように注意してください。 黄身のアクセス可能な静脈を選択して、血流が胚に向かっていることを確認します。ビテリン静脈の分岐点を選択します (図 3B, C)。注:E6.5 – E7.5では、卵黄静脈にアクセスするために、絨毛膜をピンセットで静かに脇に移動する必要があります。E8.5の後、唯一の選択肢は、この段階までに絨毛管内膜が胚を完全に覆っているので、絨毛管内膜静脈の1つに注入することです。 2 つのデュモン#5ピンセットを使用して、選択した注射点の上のビテリン膜を取り除き、反対方向に引き裂きます。 デュモン#5を使用して引っ張られたガラスの針を破り、CellTracker CM-DiIでロードする前に静脈のおおよその大きさに直径を調整します。DMSOで40μg/μlのDiIストックソリューションを作成し、-20°Cで保存します。 4 μg/μlの濃度で0.3 Mスクロース/PBSで動作溶液を調製します。 口管との吸引を使用して針に0.3 Mスクロース/PBSのDiIの5-10 μlの間の吸気。古い胚は25μl以上必要かもしれません。E8.5から、胚はより大きく、より多くの筋肉静脈を有し、DiIを装填されたガラス針で刺す前にデュモン#5の位置に保持する必要があるかもしれない。 迅速に静脈に針を挿入し、凝固を形成せずにゆっくりと血流に参加できるようにDiIが許可するように口管で着実に吹きます。あるいは、DiI送達用の圧力インジェクタを使用します。 8. 切除または全山試験のための収穫胚 できるだけ多くのDiIを胚内に保持するには、穿穿なるスプーンにすくい、まっすぐハサミで血管と結合組織を切断して、注射直後に胚を収穫し、卵黄から胚を解放する。 任意の緩い膜を除去し、関心のある器官(すなわち、このチュートリアルでは肺と消化管)を解剖し、DiIの拡散を作成する組織を圧縮しないように細心の注意を払う。直ちに、RTで1〜2時間4%PFAに浸漬して組織を固定します。 組織をPBSで5分間リンスし、5μg/ml DAPIを含むPBSで15分間リンスします。サンプルをブリッジングされた顕微鏡スライドに取り付けて、全体のマウント検査を行うか、凍結切断のために埋め込みます。