תיוג כפול של תאי ציצה עצבית וכלי דם בתוך עוברי עוף באמצעות שתל צינור עצביGFP אפרוח והזרקת צבע DiI Carbocyanine
Summary
כאן אנו מדווחים על תיוג כפול של תאי ציצה עצביים וכלי דם באמצעות השתלת צינור עצביGFP אפרוחים בשילוב עם הזרקת DiI תוך וסקולרית. טכניקה ניסיונית זו מאפשרת לנו לדמיין וללמוד בו זמנית את ההתפתחות של מערכת העצבים (האנטרית) הנגזרת מ- NCC ומערכת כלי הדם, במהלך אורגנוגנזה.
Abstract
כל האיברים המתפתחים צריכים להיות מחוברים הן למערכת העצבים (לשליטה חושית ומוטורית) והן למערכת כלי הדם (להחלפת גזים, אספקת נוזלים וחומרים מזינים). כתוצאה מכך, הן מערכות העצבים והן מערכות כלי הדם מתפתחות זו לצד זו וחולקות קווי דמיון בולטים בארכיטקטורת ההסתעפות שלהן. כאן אנו מדווחים על מניפולציות עובריות המאפשרות לנו לחקור את ההתפתחות הסימולטנית של רקמת עצבים שמקורה בסמל עצבי (במקרה זה מערכת העצבים האנטרית), ואת מערכת כלי הדם. זה מושגת על ידי יצירת כימרות עוף באמצעות השתלת קטעים נפרדים של הצינור העצבי, ואת הסמל העצבי הקשורים, בשילוב עם הזרקת DiI כלי דם באותו עובר. השיטה שלנו משתמשת בעוברים מהונדסיםשל אפרוחים GFP להשתלה תוך-מינית, מה שהופך את טכניקת ההשתלה לחזקה יותר מפרוטוקול השתלת אפרוחי השליו הקלאסי המשמש בהשפעה רבה מאז שנות השבעים. השתלת אפרוחיםGFP-אפרוחים intraspecies מאפשרת הדמיה של תאים מושתלים ואת התחזיות שלהם ברקמות שלמות, ומבטלת כל הטיה פוטנציאלית בהתפתחות התאים הקשורה להבדלים בין מינים. שיטה זו מנצלת במלואה את קלות הגישה של עובר העופות (בהשוואה לעוברים אחרים של בעלי חוליות) כדי לחקור את ההתפתחות המשותפת של מערכת העצבים האנטרית ומערכת כלי הדם.
Introduction
עובר העוף הוא אורגניזם מודל שלא יסולא בפז בביולוגיה התפתחותית של בעלי חוליות, לא פחות משום שהתפתחותו באובו מאפשרת מניפולציות ניסיוניות שאחרת בלתי אפשריות לביצוע בחולייתנים המתפתחים ברחם. נגישות זו וקלות המניפולציות הובילו לכך שעובר הגוזל ממלא תפקידי מפתח בתגליות מהותיות רבות בתחום הביולוגיה ההתפתחותית. בין הטכניקות החזקות ביותר היה השימוש בעוברים כימריים אפרוחי שליו כדי לחקור את גורל התא, שיטה חלוצית על ידי פרופסור ניקול לה Douarin בשנות ה-70 1-3. בפרט, כימרות שליו-חומוס היו שימושיים במיוחד כדי לסמן גנטית ולעקוב אחר אוכלוסיות גבוהות של תאי ציצה עצביים נודדים (NCC) במהלך ההתפתחות המוקדמת. NCC הם אוכלוסייה רב-תכליתית של תאים נודדים, הנובעת באקטודרם הגבי בשולי הצינור העצבי, המולידה מגוון רחב של סוגי תאים ברחבי העובר החולייתני. אלה כוללים מבנים craniofacial (סחוס, עצם, שרירים), נוירונים גליה (במערכת העצבים החושית והאוטונומית), מלנוציטים, ותת-אוכלוסין של תאים של המערכת האנדוקרינית2,4,5. אחד הגורמים החשובים ביותר המשפיעים על גורל NCC הוא מיקומם הראשוני לאורך הציר האחורי-ראשי של הצינור העצבי. לדוגמה, NCC אנטרי, אשר מעוררים את הנוירונים ואת גליה של מערכת העצבים האנטרית (ENS), נובעים משתי תת אוכלוסיות נפרדות: הראשון ממוקם באזור vagal (caudal hindbrain), והשני באזור sacral של הצינור העצבי6-13. השתלה בין-מינים או פנים-מינים של האזורים המתאימים של הצינור העצבי היו הטכניקות המועדפות לתייג תאים אלה לצמיתות ולאחר מכן לאפשר מעקב, מלידתם בשולי הצינור העצבי, ליעדם הסופי בתוך מערכת העיכול6,7,10.
מניפולציה עוברית נוספת שקל יותר לבצע בחומוס, בהשוואה למודלים אחרים של בעלי חיים, היא תיוג חיוני של מערכת כלי הדם. ואכן, ככל שעובר הגוזל מתפתח, הוא מונח על גבי רשת כלי דם חוץ-עוברית המסתובבת חמצן וחומרים מזינים מהחלמון. רשת כלי דם נגישה זו, הממוקמת על פני השטח של החלמון, יכולה לשמש כשער לתיוג מערכת כלי הדם המתפתחת של העובר במהלך organogenesis12,14-17. הזרקה תוך-וסקולרית של צבעים שונים, כגון צבע ליפופילי DiI, מאפשרת לציין /להכתים את כל כלי הדם הזוהרים של רשת כלי הדם המתהווה.
מכיוון שאיברים מתפתחים צריכים להיות מחוברים הן למערכת העצבים (לשליטה חושית ומוטורית) והן למערכת כלי הדם (להחלפת גזים, אספקת נוזלים וחומרים מזינים), שתי הרשתות מתפתחות זו לצד זו וחולקות קווי דמיון בולטים בארכיטקטורת ההסתעפות שלהן18-20. כאן אנו מדווחים על מניפולציות עובריות המאפשרות לנו לחקור את ההתפתחות הסימולטנית של ENS שמקורו ב- NCC, יחד עם מערכת כלי הדם, במהלך organogenesis. זה מושגת על ידי יצירת כימרות עוף באמצעות השתלת קטעים נפרדים של הצינור העצבי, כולל הסמל העצבי, בשילוב עם הזרקת DiI כלי דם. כהתקדמות מכומרות עוף שליו, השיטה שלנו משתמשת בעוברים מהונדסים של אפרוחי GFP להשתלה תוך-מין, מה שהופך את טכניקת ההשתלה לחזקה יותר, במונחים של תאי הדמיה והתחזיות שלהם, ומבטל כל הטיה פוטנציאלית הקשורה להבדלים בין מינים.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה של השתלת צינור עצבי intraspecies, בשילוב עם תיוג כלי דם המתוארים כאן, מנצלת במלואה את קלות הגישה של עובר העופות בתוך הביצית (בהשוואה לעוברים אחרים של בעלי חוליות) כדי לחקור את ההתפתחות המשותפת של אלמנט של מערכת העצבים האוטונומית (ENS) ומערכת כלי הדם.
עבור תיוג נגזרות NCC, שיטת השתלת אפרוחיםGFP-אפרוחים פנים-מין שאנו מתארים יש מספר יתרונות על פני שיטת כימרה קלאסית שליו אפרוח שהוקם לפני למעלה מ -40 שנה1-3. ראשית, תחת אור FITC, פלואורסצנטיות GFP היא בהירה ביותר, במידה שתאי GFP+ ניתנים להבחנה בקלות בעוברים כימריים חיים. זה מאפשר את ההצלחה של השתל להיבדק ovo, ואילו השתלת אפרוחי שליו דורש העובר להיהרג, מעובד immunostained באמצעות QCPN, לפני ההצלחה של השתל ניתן לברר2. שנית, ביטוי GFPב- GFP אפרוח מהונדס הוא ציטופלסמי, ולכן זה לא רק מתייג גופי תאים, אלא גם מאפשר את ההקרנות של התאים המושתלים להיות דמיינו22. זה מאפשר רשתות עצביות מורכבות להיות שנצפו ברזולוציה גבוהה (שים לב כי תחזיות עדינות הם דמיינו בצורה הטובה ביותר כאשר המדגם הוא immunostained עם נוגדן נגד GFP). כמו תיוג QCPN מוגבל גרעין התא שליו, רשתות כאלה אינם נחשפים באמצעות כימרות שליו-חומוס. שלישית, השתלת intraspecies מבטלת את כל ההבדלים המינים הפוטנציאליים בין תאים בתוך העובר הכימרי. מאז עוברי שליו יש תקופת דגירה קצרה יותר מאשר אפרוח (19 ימים לעומת 21 ימים) הוצע כי תאים שליו יש שיעור התפשטות גבוה יותר מאשר תאי אפרוח, אשר עלול להשפיע על התפתחות הרקמות הכימריות23. מעניין גם, הוכח בצמחים כי השתלת interspecies יכול לייצר שינויים נרחבים בדפוסי מתילציה DNA המארח 24. רביעית,אפרוח GFP מקל על ניסויים השתלת גב כדי לטפל בנושאים כגון גורל NCC ומחויבות התא25. החמישית,GFP אפרוח מהונדס שימושי גם עבור טכניקות רבות אחרות, כולל מיון FACS של תת-אוכלוסייה של תא GFP + , תרבות organotypic של איברים המכילים GFP + תאים, מניפולציה גנטית של GFP + רקמה מושתלת באמצעות electroporation של פלסמידים ביטוי26, וטכנולוגיות הדמיה אחרות כגון טומוגרפיה הקרנהאופטית 27.
ניתן לשנות את גישת השתלת הצינור העצבי על ידי החלפה מיקרוכירורגית של כמויות קצרות יותר של צינור עצבי. על ידי שימוש במקטעים קטנים יותר של צינור עצבי המיקרוכירורגיה עלולה להיות פחות מזיקה לעובר וניתן לשפר את ההישרדות. עם זאת, החיסרון של השתלת צינור עצבי פחות הוא כי המספרים של GFP + NCC במארח יופחת. משתמשים יכולים לנסות ולהשיג איזון בין כמות הצינור העצבי מושתל לתת הישרדות אופטימלית של עוברים, ואת המספרים של GFP + NCC בתוך המעי המארח מספיק כדי לתת תוצאות אינפורמטיביות.
עבור ציור כלי שיט, ל- DiI יש את היתרון שהפלואורסצנטיות שלו בהירה וחזקה מאוד. כמו כן, יש לו את היכולת להתפזר במהלך קיבעון הבטחת כתמים של נימים פתוחים הטובים ביותר. מכיוון שמדובר בצבע חיוני, עוברים יכולים לשרוד את הליך ההזרקה ולהמשיך להתפתח עם מערכת כלי דם מוכתמת (עד 24 שעות בידיים שלנו, אם כי הכתם הופך להיות יותר נוקב לאורך זמן, ראה איור 3E). השילוב של השתלתGFP אפרוח עם ציור כלי דם DiI ולכן תואם הדמיה חיה. מלבד כל היתרונות הללו, חשוב לציין כי הזרקת כלי דם רק מתייגת כלי זוהר ולכן אינה מזהה נימים שלא נפתחו, תאי קצה אנדותל או תאי אנדותל מבודדים. עם זאת, התקדמות נוספת transgenesis העופות יכול לספק דרכים חדשות לעקוף נושאים כאלה, כפי שמדגים ניסויים באמצעות Tg(עניבה1:H2B-eYFP) שליו עוברים ללמוד מורפוגנזה כלידם 28. מגבלה נוספת של טכניקה זו היא, עבור תיוג כלי יעיל בעוברים ב E7.5 ומעבר, כמויות גדולות יותר של צבע צריך להיות מוזרק, אשר יכול להפוך ניסויים יקרים. עם זאת, שינוי של הטכניקה יכול לכלול עלות נמוכה כלי דם תיוג סימון דיו14, אם כי גישה זו לא נוסתה בידיים שלנו.
שלבים קריטיים של ההליכים כוללים את תהליך הדמיית העובר על ידי הזרקת דיו מתחת לבצק. אם הממברנה המכסה את החלמון נקרעת על ידי המחט המלאה בדיו בשלב זה אז הישרדות העובר נפגעת קשות. כמו כן, חשוב, בעת הכנת צינור עצבי תורם, כי הרקמה לא נשאר במשך זמן רב מדי בלבלב (לשקול כ 10 דקות כמקסימום). חשיפה ממושכת ללבלב פוגעת ברקמה והצינור העצבי קשה לאחר מכן לטפל בו והוא לא ישלב היטב במארח. צובר ניסיון של טכניקת הזרקת DiI על עוברים מסוג בר הוא חיוני לפני הזרקת עוברים כימריים, כמו רק ניסיון אחד בהזרקה אפשרי בדרך כלל עבור כל עובר. נפח DII וקוטר מחט הם פרמטרים קריטיים עבור כל עובר ויש להעריך על סוג פראי, פקדים תואמי שלב.
לסיכום, שיטת התיוג הכפולה שלנו של השתלת צינור עצבי וציור כלי DiI בעוברים של אפרוחים חיים יכולה לשמש כדי לחקור את היחסים ההדדיים בין רשתות NCC וכלי דם במהלך organogenesis. בהתחשב במנגנונים האחראים על ביסוס היעד הנכון innervation ו vascularization במהלך פיתוח איברים עדיין ידועים במידה רבה, מתודולוגיה זו מחזיקה פוטנציאל תגליות עתידיות בתחום זה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ביצי עוף מופרות של GFP סופקו על ידי פרופ’ הלן סאנג, מכון רוזלין ואוניברסיטת אדינבורו, בריטניה. מתקן העוף הטרנסגני רוזלין ממומן על ידי קרן Wellcome ועל ידי המועצה לחקר הביוטכנולוגיה והמדעים הביולוגיים (BBSRC). העבודה מומנה בחלקה, ו- NT נתמך על ידי בית החולים גרייט אורמונד סטריט צדקה לילדים, לונדון, בריטניה. המחברים מודים לבן יוונס, מכון UCL לבריאות הילד, על העזרה בהכנת עוברים להשתלה.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number |
| Fertilised chick eggs | Henry Stewart and Co, Louth, UK | |
| Fertilised GFP chick eggs | The Transgenic Chicken Facility, The Roslin Institute, The University of Edinburgh | |
| Egg incubator (Profi-H Hatcher) | Lyon Technologies, CA, USA | 910-033 |
| 14C Incubator | Precision Cooled Incubator, Leec Ltd., Nottingham, UK | Model LT2 |
| Stereo-microscope | LEICA | Model MZ 12.5 |
| Digital Camera | LEICA | DC500 |
| Image acquisition software | LEICA | IM50 |
| Goose neck halogen cold light source | Advanced Imaging Concepts, Inc | KL 1500 LCD |
| 181⁄2 G hypodermic needle | SIGMA – ALDRICH | HSWNH181 |
| Pancreatin | SIGMA – ALDRICH | P3292 |
| DMEM | SIGMA – ALDRICH | D5030 |
| Goat serum | SIGMA – ALDRICH | G6767 |
| 5ml syringe | SIGMA – ALDRICH | Z248010 |
| Mouth tube | SIGMA – ALDRICH | A5177 |
| Sigma Pasteur pipettes non-plugged, L 5 3/4 in. | SIGMA – ALDRICH | S6018 |
| Transfer pipettes, polyethylene | SIGMA – ALDRICH | Z350796 |
| Borosillicate glass capillaries, thin wall without filament | Harvard apparatus | PY8 30-0035 |
| Iris Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 |
| Curved Iris Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14059-09 |
| Needle holders (Nickel-plated pin holder) | Fine Science Tools | 26018-17 |
| Pascheff-Wolff Spring Scissors | Fine Science Tools | 15371-92 |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-15 |
| Dumont AA forceps, Inox Epoxy- coated | Fine Science Tools | 11210-10 |
| Perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-18 |
| Tungsten needles (0.125mm diameter) | Fine Science Tools | 10130-05 |
| Sellotape (clear, 24mm width) | Any Supplier | |
| Pen/Strep (Penicillin, Streptomycin) Solution | VWR international | 101447-068 |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | S09 512 516 |
| Pelikan black ink | Pelikan | 211-169 |
| CellTracker CM-DiI | Molecular Probes | C-7001 |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Molecular Probes | D1306 |
| Settings for glass needle puller | Sutter Instruments | Flaming/Brown micropipette puller model P-86 |
| Heat 950; Pull 150; Velocity 100; Time 200; Pressure 500 |
References
- Le Douarin, N. A biological cell labeling technique and its use in expermental embryology. Developmental Biology. 30, 217-222 (1973).
- Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. Quail-chick chimeras. Methods in Molecular Biology. 461, 337-350 (2008).
- Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. Quail-chick chimeras. Methods in Molecular Biology. 97, 305-318 (1999).
- Garcia-Castro, M., Bronner-Fraser, M. Induction and differentiation of the neural crest. Current Opinion In. Cell Biology. 11, 695-698 (1999).
- Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in Mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 5, (2013).
- Burns, A. J., Douarin, N. M. The sacral neural crest contributes neurons and glia to the post-umbilical gut: spatiotemporal analysis of the development of the enteric nervous system. Development. 125, 4335-4347 (1998).
- Burns, A. J., Le Douarin, N. M. Enteric nervous system development: analysis of the selective developmental potentialities of vagal and sacral neural crest cells using quail-chick chimeras. The Anatomical Record. 262, 16-28 (2001).
- Burns, A. J., Delalande, J. M., Le Douarin, N. M. In ovo transplantation of enteric nervous system precursors from vagal to sacral neural crest results in extensive hindgut colonisation. Development. 129, 2785-2796 (2002).
- Burns, A. J., Champeval, D., Le Douarin, N. M. Sacral neural crest cells colonise aganglionic hindgut in vivo but fail to compensate for lack of enteric ganglia. Developmental Biology. 219, 30-43 (1006).
- Wang, X., Chan, A. K., Sham, M. H., Burns, A. J., Chan, W. Y. Analysis of the sacral neural crest cell contribution to the hindgut enteric nervous system in the mouse embryo. Gastroenterology. 141, 992-1002 (2011).
- Goldstein, A. M., Hofstra, R. M., Burns, A. J. Building a brain in the gut: development of the enteric nervous system. Clinical Genetics. 83, 307-316 (1111).
- Delalande, J. M., et al. Vascularisation is not necessary for gut colonisation by enteric neural crest cells. Developmental Biology. 385, 220-229 (2014).
- Anderson, R. B., Stewart, A. L., Young, H. M. Phenotypes of neural-crest-derived cells in vagal and sacral pathways. Cell And Tissue Research. 323, 11-25 (2006).
- Takase, Y., Tadokoro, R., Takahashi, Y. Low cost labeling with highlighter ink efficiently visualizes developing blood vessels in avian and mouse embryos. Development, Growth & Differentiation. 55, 792-801 (2013).
- Bates, D., Taylor, G. I., Newgreen, D. F. The pattern of neurovascular development in the forelimb of the quail embryo. Developmental Biology. 249, 300-320 (2002).
- Mayes, P., Dicker, D., Liu, Y., El-Deiry, W. Noninvasive vascular imaging in fluorescent tumors using multispectral unmixing. BioTechniques. 45, 459-460 (2008).
- Li, Y., et al. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3, 1703-1708 (2008).
- Eichmann, A., Thomas, J. L. Molecular parallels between neural and vascular development. Cold Spring Harbor Perspectives In Medicine. 3, a006551 (2013).
- Weinstein, B. M. Vessels and nerves: marching to the same tune. Cell. 120, 299-302 (2005).
- Carmeliet, P., Tessier-Lavigne, M. Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring. Nature. 436, 193-200 (2005).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21040-21045 (2010).
- Senut, M. C., Alvarado-Mallart, R. M. Cytodifferentiation of quail tectal primordium transplanted homotopically into the chick embryo. Brain Research. 429, 187-205 (1987).
- Wu, R., et al. Inter-species grafting caused extensive and heritable alterations of DNA methylation in Solanaceae plants. PLoS One. 8, e61995 (2013).
- Freem, L. J., Delalande, J. M., Campbell, A. M., Thapar, N., Burns, A. J. Lack of organ specific commitment of vagal neural crest cell derivatives as shown by back-transplantation of GFP chicken tissues. The International Journal Of Developmental Biology. 56, 245-254 (2012).
- Delalande, J. M., et al. The receptor tyrosine kinase RET regulates hindgut colonization by sacral neural crest cells. Developmental Biology. 313, 279-292 (2008).
- Freem, L. J., et al. The intrinsic innervation of the lung is derived from neural crest cells as shown by optical projection tomography in Wnt1-Cre;YFP reporter mice. Journal of Anatomy. 217, 651-664 (2010).
- Sato, Y., et al. Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos. PloS One. 5, e12674 (2010).
