وضع العلامات المزدوجة من خلايا كريست العصبية والأوعية الدموية داخل أجنة الدجاج باستخدام الفرخGFP تطعيم الأنبوب العصبي وكاروتشيانين صبغ DiI حقن
Summary
هنا نحن تقرير وضع العلامات المزدوجة من الخلايا قمة العصبية والأوعية الدموية باستخدام الفرخGFP أنبوب العصبية تطعيم داخل الأنواع جنبا إلى جنب مع حقن DiI داخل الأوعية الدموية. هذه التقنية التجريبية تسمح لنا في وقت واحد تصور ودراسة تطوير الجهاز العصبي (المعوي) المستمدة من NCC والجهاز الوعائي، أثناء تكوين الجهاز العضوي.
Abstract
جميع الأعضاء النامية تحتاج إلى أن تكون متصلة بكل من الجهاز العصبي (للتحكم الحسي والحركي) وكذلك نظام الأوعية الدموية (لتبادل الغاز والسوائل وإمدادات المواد الغذائية). وبالتالي ، فإن كلا من الجهاز العصبي والأوعية الدموية يتطوران جنبا إلى جنب ويشتركان في أوجه التشابه المذهلة في هندستهما المعمارية المتفرعة. هنا نبلغ عن التلاعب الجنيني الذي يسمح لنا بدراسة التطور المتزامن للأنسجة العصبية المشتقة من القمة العصبية (في هذه الحالة الجهاز العصبي المعوي) ، ونظام الأوعية الدموية. ويتحقق ذلك عن طريق توليد الكيميرا الدجاج عن طريق زرع أجزاء منفصلة من الأنبوب العصبي، والقمة العصبية المرتبطة بها، جنبا إلى جنب مع حقن DiI الأوعية الدموية في نفس الجنين. تستخدم طريقتنا أجنةGFP المعدلة وراثيا للتطعيم داخل الأنواع ، مما يجعل تقنية الزراعة أقوى من بروتوكول تطعيم السمان – الفرخ الكلاسيكي المستخدم بتأثير كبير منذ السبعينيات. الفرخGFP-chick تطعيم داخل الأنواع يسهل تصوير الخلايا المزروعة وتوقعاتها في الأنسجة سليمة، ويقضي على أي تحيز محتمل في تطوير الخلايا المرتبطة الاختلافات الأنواع. تستفيد هذه الطريقة استفادة كاملة من سهولة وصول جنين الطيور (مقارنة بالأجنة الفقارية الأخرى) لدراسة التطور المشترك للجهاز العصبي المعوي والجهاز الوعائي.
Introduction
جنين الدجاج هو كائن حي نموذج لا يقدر بثمن في بيولوجيا النمو الفقارية، وليس أقلها لأن تطوره في أوفو يسمح التلاعب التجريبية التي من المستحيل على خلاف ذلك لأداء في الفقاريات التي تتطور في الرحم. وقد أدت هذه إمكانية الوصول وسهولة التلاعب إلى أن يلعب جنين الفرخ أدوارا رئيسية في العديد من الاكتشافات المنوية في مجال البيولوجيا التنموية. وكان من بين أقوى التقنيات استخدام أجنة السمان فرخ chimeric لدراسة مصير الخلية، وهي طريقة رائدة من قبل البروفيسور نيكول لو دوارين في 19701-3. على وجه الخصوص ، كانت الكيميرا السمان فرخ مفيدة بشكل خاص لوضع علامة وراثيا ومتابعة السكان الخلايا قمة العصبية المهاجرة للغاية (NCC) خلال التنمية المبكرة. NCC هي مجموعة متعددة القدرات من الخلايا المهاجرة ، تنشأ في ectoderm الظهرية على هامش الأنبوب العصبي ، التي تؤدي إلى مجموعة واسعة من أنواع الخلايا في جميع أنحاء الجنين الفقاري. وتشمل هذه الهياكل القحفية (الغضروف والعظام والعضلات) والخلايا العصبية وغليا (في الجهاز العصبي الحسي والعالذاتي) ، والخلايا الصباغية ، واكتظاظ خلايا نظام الغدد الصماء2،4،5. أحد أهم العوامل التي تؤثر على مصير NCC هو موقعها الأولي على طول المحور الأمامي الخلفي للأنبوب العصبي. على سبيل المثال ، ينشأ NCC المعوي ، الذي يؤدي إلى الخلايا العصبية والغليا في الجهاز العصبي المعوي (ENS) ، من مجموعتين فرعيتين منفصلتين: الأولى تقع في منطقة ال vagal (caudal hindbrain) ، والثانية في المنطقة العجزية للأنبوب العصبي6-13. وقد تم تطعيم بين أو داخل الأنواع من المناطق المقابلة من الأنبوب العصبي التقنيات المفضلة لتسمية هذه الخلايا بشكل دائم والسماح في وقت لاحق تتبع, من ولادتهم على هامش الأنبوب العصبي, إلى وجهاتهم النهائية داخل الجهاز الهضمي6,7,10.
تلاعب جنيني آخر أسهل في الأداء في الفرخ ، مقارنة بالنماذج الحيوانية الأخرى ، هو وضع العلامات الحيوية لنظام الأوعية الدموية. في الواقع ، مع تطور جنين الفرخ ، فإنه يضع على رأس شبكة الأوعية الدموية خارج الجنين التي تعمم الأكسجين والمواد المغذية من الصفار. يمكن استخدام هذه الشبكة الوعائية التي يمكن الوصول إليها ، الموجودة على سطح الصفار ، كبوابة لتسمية نظام الأوعية الدموية النامي للجنين أثناء تكوين الأعضاءالعضوية 12،14-17. الحقن داخل الأوعية الدموية من الأصباغ المختلفة، مثل صبغة الدهون DiI، يجعل من الممكن تحديد / وصمة عار جميع الأوعية مضيئة من شبكة الأوعية الدموية الوليدة.
لأن تطوير الأجهزة تحتاج إلى أن تكون متصلة بكل من الجهاز العصبي (للتحكم الحسي والحركي) وكذلك نظام الأوعية الدموية (لتبادل الغاز والسوائل وإمدادات المواد الغذائية)، والشبكتين تطوير جنبا إلى جنب مع بعضها البعض وتبادل أوجه التشابه ملفتة للنظر في هندستها المعمارية المتفرعة18-20. هنا نبلغ عن التلاعب الجنيني الذي يسمح لنا بدراسة التطور المتزامن ل ENS المشتقة من NCC ، جنبا إلى جنب مع نظام الأوعية الدموية ، أثناء تكوين الأعضاء. ويتحقق ذلك عن طريق توليد الكيميرا الدجاج عن طريق زرع أجزاء منفصلة من الأنبوب العصبي، بما في ذلك قمة العصبية، جنبا إلى جنب مع حقن ديي الأوعية الدموية. كتأسف من الكيميرا الدجاج السمان، طريقتنا يستخدم الأجنة الفرخ GFP المعدلة وراثيا لتطعيم الأنواع الداخلية، مما يجعل تقنية زرع أكثر قوة، من حيث خلايا التصوير وتوقعاتها، والقضاء على أي تحيز محتمل مرتبط باختلافات الأنواع.
Protocol
Representative Results
Discussion
طريقة تطعيم الأنبوب العصبي داخل الأنواع ، جنبا إلى جنب مع وضع العلامات على الأوعية الدموية الموصوفة هنا ، تستفيد استفادة كاملة من سهولة وصول جنين الطيور داخل البويضة (مقارنة بالأجنة الفقارية الأخرى) لدراسة التطوير المشترك لعنصر من عناصر الجهاز العصبي اللاإرادي (ENS) والجهاز الوعائي.
لتسمية مشتقات NCC ، فإن طريقة تطعيم الفرخGFP-chick intraspecies التي نصفها لديها عدد من المزايا على طريقة السمان – الفرخ الكلاسيكية التي تم إنشاؤها منذ أكثر من 40 عاما1-3. أولا، تحت ضوء FITC، GFP مضان مشرق للغاية، لدرجة أن خلايا GFP + يمكن تمييزها بسهولة في الأجنة الشميرية الحية. وهذا يسمح لنجاح الكسب غير المشروع ليتم فحصها في أوفو، في حين أن تطعيم السمان فرخ يتطلب الجنين أن يقتل ، ومعالجتها والملطخة بالمناعة باستخدام QCPN ، قبل نجاح الكسب غير المشروع يمكن التأكد2. ثانيا، التعبير GFP فيGFP الفرخ المعدلة وراثيا هو السيتوبلازمية، وبالتالي فإنه ليس فقط تسميات أجسام الخلايا، ولكن أيضا يسمح لإسقاطات الخلايا المزروعة أن تصور22. وهذا يسمح الشبكات العصبية المعقدة أن يلاحظ في قرار عالية (لاحظ أن أفضل تصور التوقعات الدقيقة عندما تكون العينة مناعة ملطخة الأجسام المضادة لGFP). كما يقتصر وضع العلامات QCPN لنواة خلية السمان، لا يتم الكشف عن مثل هذه الشبكات باستخدام السمان فرخ الوهم. ثالثا، التطعيم داخل الأنواع يزيل أي اختلافات محتملة بين الأنواع بين الخلايا داخل الجنين الشيمي. منذ أجنة السمان لديها فترة حضانة أقصر من الفرخ (19 يوما مقابل 21 يوما) وقد اقترح أن خلايا السمان لديها معدل انتشار أعلى من خلايا الفرخ، والتي يمكن أن تؤثر على تطوير الأنسجة الشميرية23. ومن المثير للاهتمام أيضا، وقد ثبت في النباتات أن تطعيم بين الأنواع يمكن أن تنتج تعديلات واسعة النطاق في أنماط ميثيل الحمض النووي في المضيف 24. رابعا، الفرخGFP يسهل تجارب زرع الظهر لمعالجة مواضيع مثل مصير NCC والتزام الخلية25. خامسا ، الفرخ المعدل وراثياGFP مفيد أيضا للعديد من التقنيات الأخرى بما في ذلك فرز FACS من الخلايا الفرعية GFP + ، والثقافة العضوية للأعضاء التي تحتوي على خلايا GFP + ، والتلاعب الجيني للأنسجة GFP + المطعمة عن طريق الكهرومporation من البلازميدات التعبير26، وغيرها من تقنيات التصوير مثل التصوير المقطعي الإسقاط البصري27.
يمكن تعديل نهج زرع الأنبوب العصبي عن طريق استبدال كميات أقصر من الأنبوب العصبي جراحيا. باستخدام أجزاء أصغر من الأنبوب العصبي الجراحة المجهرية يحتمل أن تكون أقل ضررا على الجنين ويمكن تحسين البقاء على قيد الحياة. ومع ذلك ، فإن الجانب السلبي لزرع أنبوب عصبي أقل هو أن أعداد GFP + NCC في المضيف سيتم تخفيضها. يمكن للمستخدمين محاولة تحقيق توازن بين كمية الأنبوب العصبي المزروعة لإعطاء البقاء الأمثل للأجنة، وأعداد GFP + NCC داخل الأمعاء المضيفة كافية لإعطاء نتائج مفيدة.
بالنسبة لطلاء السفن ، تتمتع DiI بميزة أن مضانها مشرق وقوي للغاية. أيضا، لديها القدرة على الانتشار أثناء التثبيت ضمان تلطيخ أرقى الشعيرات الدموية المفتوحة. نظرا لأنه صبغة حيوية ، يمكن للأجنة البقاء على قيد الحياة في إجراء الحقن والاستمرار في التطور مع نظام الأوعية الدموية الملطخة (حتى 24 ساعة في أيدينا ، على الرغم من أن التلطيخ يصبح أكثر وضوحا بمرور الوقت ، انظر الشكل 3E). وبالتالي فإن الجمع بين تطعيمالفرخ GFP مع لوحة الأوعية الدموية DiI متوافق مع التصوير الحي. وإلى جانب كل هذه المزايا، من المهم أن نلاحظ أن حقن الأوعية الدموية تسميات الأوعية مضيئة فقط، وبالتالي لا يحدد الشعيرات الدموية غير مفتوحة، وخلايا تلميح البطانية أو الخلايا البطانية المعزولة. ومع ذلك، يمكن أن يوفر المزيد من التقدم في تكوين الطيور طرقا جديدة للتحايل على مثل هذه القضايا، كما يتضح من التجارب باستخدام أجنة السمان Tg (tie1:H2B-eYFP) لدراسة مورفوجينيسيس الأوعية الدموية28. وثمة قيد آخر لهذه التقنية هو أنه من أجل وضع علامات فعالة على الأوعية في الأجنة في E7.5 وما بعدها، يجب حقن كميات أكبر من الصبغة، مما قد يجعل التجارب مكلفة. ومع ذلك، يمكن أن يتضمن تعديل هذه التقنية منخفضة التكلفة الأوعية الدموية وضع العلامات على الحبر قلم تمييز14،على الرغم من أن هذا النهج لم يجرب في أيدينا.
وتشمل الخطوات الحاسمة للإجراءات عملية تصور الجنين عن طريق حقن الحبر تحت blastodisc. إذا تمزق الغشاء الذي يغطي صفار بواسطة إبرة مملوءة بالحبر في هذه المرحلة ثم بقاء الجنين للخطر الشديد. أيضا، من المهم، عند إعداد الأنبوب العصبي المانحة، أن لا تترك الأنسجة لفترة طويلة بشكل مفرط في البنكرياس (النظر في ما يقرب من 10 دقيقة كحد أقصى). التعرض لفترات طويلة لتلف البنكرياس الأنسجة وأنبوب العصبي ثم من الصعب التعامل معها، وأنها لن تدرج بشكل جيد في المضيف. اكتساب الخبرة في تقنية حقن DiI على الأجنة البرية من النوع ضروري قبل حقن الأجنة الشميرية ، حيث أن محاولة واحدة فقط للحقن ممكنة بشكل عام لكل جنين. حجم DiI وقطر الإبرة هي المعلمات الحاسمة لكل جنين، وينبغي تقييمها على نوع البرية، والضوابط المرحلة المتطابقة.
في الختام، يمكن استخدام طريقة وضع العلامات المزدوجة الخاصة بنا لزرع الأنبوب العصبي ورسم وعاء DiI في أجنة الفرخ الحية للتحقيق في العلاقات بين NCC وشبكات الأوعية الدموية أثناء تكوين الأعضاء. وبالنظر إلى أن الآليات المسؤولة عن تحديد التدين المستهدف الصحيح والأوعية الدموية أثناء تطور الأعضاء لا تزال غير معروفة إلى حد كبير، فإن هذه المنهجية تحمل إمكانات الاكتشافات المستقبلية في هذا المجال.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم توفير بيض الدجاج المخصب GFP من قبل البروفيسور هيلين سانغ، معهد روزلين، وجامعة أدنبرة، المملكة المتحدة. يتم تمويل مرفق روزلين للدجاج المعدل وراثيا من قبل صندوق ويلكوم ومجلس أبحاث التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية (BBSRC). تم تمويل العمل جزئيا، ودعم NT، من قبل جمعية مستشفى غريت أورموند ستريت الخيرية للأطفال، لندن، المملكة المتحدة. يشكر المؤلفون بن جيفانس، معهد UCL لصحة الطفل، للمساعدة في إعداد الأجنة ل التطعيم.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number |
| Fertilised chick eggs | Henry Stewart and Co, Louth, UK | |
| Fertilised GFP chick eggs | The Transgenic Chicken Facility, The Roslin Institute, The University of Edinburgh | |
| Egg incubator (Profi-H Hatcher) | Lyon Technologies, CA, USA | 910-033 |
| 14C Incubator | Precision Cooled Incubator, Leec Ltd., Nottingham, UK | Model LT2 |
| Stereo-microscope | LEICA | Model MZ 12.5 |
| Digital Camera | LEICA | DC500 |
| Image acquisition software | LEICA | IM50 |
| Goose neck halogen cold light source | Advanced Imaging Concepts, Inc | KL 1500 LCD |
| 181⁄2 G hypodermic needle | SIGMA – ALDRICH | HSWNH181 |
| Pancreatin | SIGMA – ALDRICH | P3292 |
| DMEM | SIGMA – ALDRICH | D5030 |
| Goat serum | SIGMA – ALDRICH | G6767 |
| 5ml syringe | SIGMA – ALDRICH | Z248010 |
| Mouth tube | SIGMA – ALDRICH | A5177 |
| Sigma Pasteur pipettes non-plugged, L 5 3/4 in. | SIGMA – ALDRICH | S6018 |
| Transfer pipettes, polyethylene | SIGMA – ALDRICH | Z350796 |
| Borosillicate glass capillaries, thin wall without filament | Harvard apparatus | PY8 30-0035 |
| Iris Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 |
| Curved Iris Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14059-09 |
| Needle holders (Nickel-plated pin holder) | Fine Science Tools | 26018-17 |
| Pascheff-Wolff Spring Scissors | Fine Science Tools | 15371-92 |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-15 |
| Dumont AA forceps, Inox Epoxy- coated | Fine Science Tools | 11210-10 |
| Perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-18 |
| Tungsten needles (0.125mm diameter) | Fine Science Tools | 10130-05 |
| Sellotape (clear, 24mm width) | Any Supplier | |
| Pen/Strep (Penicillin, Streptomycin) Solution | VWR international | 101447-068 |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | S09 512 516 |
| Pelikan black ink | Pelikan | 211-169 |
| CellTracker CM-DiI | Molecular Probes | C-7001 |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Molecular Probes | D1306 |
| Settings for glass needle puller | Sutter Instruments | Flaming/Brown micropipette puller model P-86 |
| Heat 950; Pull 150; Velocity 100; Time 200; Pressure 500 |
References
- Le Douarin, N. A biological cell labeling technique and its use in expermental embryology. Developmental Biology. 30, 217-222 (1973).
- Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. Quail-chick chimeras. Methods in Molecular Biology. 461, 337-350 (2008).
- Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. Quail-chick chimeras. Methods in Molecular Biology. 97, 305-318 (1999).
- Garcia-Castro, M., Bronner-Fraser, M. Induction and differentiation of the neural crest. Current Opinion In. Cell Biology. 11, 695-698 (1999).
- Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in Mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 5, (2013).
- Burns, A. J., Douarin, N. M. The sacral neural crest contributes neurons and glia to the post-umbilical gut: spatiotemporal analysis of the development of the enteric nervous system. Development. 125, 4335-4347 (1998).
- Burns, A. J., Le Douarin, N. M. Enteric nervous system development: analysis of the selective developmental potentialities of vagal and sacral neural crest cells using quail-chick chimeras. The Anatomical Record. 262, 16-28 (2001).
- Burns, A. J., Delalande, J. M., Le Douarin, N. M. In ovo transplantation of enteric nervous system precursors from vagal to sacral neural crest results in extensive hindgut colonisation. Development. 129, 2785-2796 (2002).
- Burns, A. J., Champeval, D., Le Douarin, N. M. Sacral neural crest cells colonise aganglionic hindgut in vivo but fail to compensate for lack of enteric ganglia. Developmental Biology. 219, 30-43 (1006).
- Wang, X., Chan, A. K., Sham, M. H., Burns, A. J., Chan, W. Y. Analysis of the sacral neural crest cell contribution to the hindgut enteric nervous system in the mouse embryo. Gastroenterology. 141, 992-1002 (2011).
- Goldstein, A. M., Hofstra, R. M., Burns, A. J. Building a brain in the gut: development of the enteric nervous system. Clinical Genetics. 83, 307-316 (1111).
- Delalande, J. M., et al. Vascularisation is not necessary for gut colonisation by enteric neural crest cells. Developmental Biology. 385, 220-229 (2014).
- Anderson, R. B., Stewart, A. L., Young, H. M. Phenotypes of neural-crest-derived cells in vagal and sacral pathways. Cell And Tissue Research. 323, 11-25 (2006).
- Takase, Y., Tadokoro, R., Takahashi, Y. Low cost labeling with highlighter ink efficiently visualizes developing blood vessels in avian and mouse embryos. Development, Growth & Differentiation. 55, 792-801 (2013).
- Bates, D., Taylor, G. I., Newgreen, D. F. The pattern of neurovascular development in the forelimb of the quail embryo. Developmental Biology. 249, 300-320 (2002).
- Mayes, P., Dicker, D., Liu, Y., El-Deiry, W. Noninvasive vascular imaging in fluorescent tumors using multispectral unmixing. BioTechniques. 45, 459-460 (2008).
- Li, Y., et al. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3, 1703-1708 (2008).
- Eichmann, A., Thomas, J. L. Molecular parallels between neural and vascular development. Cold Spring Harbor Perspectives In Medicine. 3, a006551 (2013).
- Weinstein, B. M. Vessels and nerves: marching to the same tune. Cell. 120, 299-302 (2005).
- Carmeliet, P., Tessier-Lavigne, M. Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring. Nature. 436, 193-200 (2005).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21040-21045 (2010).
- Senut, M. C., Alvarado-Mallart, R. M. Cytodifferentiation of quail tectal primordium transplanted homotopically into the chick embryo. Brain Research. 429, 187-205 (1987).
- Wu, R., et al. Inter-species grafting caused extensive and heritable alterations of DNA methylation in Solanaceae plants. PLoS One. 8, e61995 (2013).
- Freem, L. J., Delalande, J. M., Campbell, A. M., Thapar, N., Burns, A. J. Lack of organ specific commitment of vagal neural crest cell derivatives as shown by back-transplantation of GFP chicken tissues. The International Journal Of Developmental Biology. 56, 245-254 (2012).
- Delalande, J. M., et al. The receptor tyrosine kinase RET regulates hindgut colonization by sacral neural crest cells. Developmental Biology. 313, 279-292 (2008).
- Freem, L. J., et al. The intrinsic innervation of the lung is derived from neural crest cells as shown by optical projection tomography in Wnt1-Cre;YFP reporter mice. Journal of Anatomy. 217, 651-664 (2010).
- Sato, Y., et al. Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos. PloS One. 5, e12674 (2010).
