Исследование тучных клеток секреторных гранул; от биосинтеза к экзоцитозу

Тучные клетки (ТК) являются иммунные клетки, которые лучше всего известны за их участие в аллергических и воспалительных реакций, таких как артрит, астма, эозинофильный эзофагит, хронический дерматит и анафилактический шок ^1,2, а также других патологий, включая болезнь коронарных артерий ^3,5 и Рак ^3,4. Кроме того, МС играют важную роль в врожденного и адаптивного иммунитета, как в иммунной защиты против бактерий и паразитов и подавления иммунного ответа, например, индуцирующего аллотрансплантата толерантности ^5,6.

МС происходят из костного мозга, развивается от CD34 + / CD117 + плюрипотентные клетки-предшественники ^7. Совершенные костного мозга MC предшественники попадают в кровь и мигрируют в периферические ткани локализовать преимущественно в соединительной ткани и эпителиальные поверхности ^8. Созревание и терминальная дифференцировка, в конечном итоге достигается под влиянием OF цитокины в пределах окружающей среде ^8,9.

МС может быть активирован аллергена (антигена, Ag), чья встреча привела к образованию иммуноглобулина Е (IgE) тип антител. Связывание такой IgE к FcεRI рецепторов МК, за ними следуют сшивания клеток, связанного IgE при повторном воздействии того же Ag, приводит к FcεRI агрегации и начала сигнального каскада, который завершается в дегрануляции ячейки [рассмотрены в ^10,11] , МС также активируются, независимо от IgE, по нейропептидов ^5,12, токсины ^13, бактериальных и вирусных антигенов ^14,15, количество положительно заряженных пептидов совместно именуемые основных секреции, иммунных клеток и цитокинов ^{5,13,12,16 17.} МС также активируется многие из их собственных выпущенных медиаторов, которые дополнительно усиливают воспалительную реакцию.

МС упакованы с секреторных гранул (SGS), которые содержат иммунорегулирующих посредники, в том числе вазоактивных аминов, таких как гистамин и серотонин (у грызунов), протеогликанов, протеаз, таких как химазы и триптазы, фактора роста эндотелия сосудов и нескольких цитокинов и хемокинов ^8,9. Эти посредники "готов пойти" и один раз МС активируются соответствующего стимула, эти посредники освобождаются из клеток регулируется экзоцитоза (дегрануляции) в течение нескольких секунд до минут ^18,19. Это исходное событие следует путем синтеза De Novo и выделением большого массива биологически сильнодействующих веществ, в том числе метаболитов арахидоновой кислоты, несколько цитокинов и хемокинов ^20,21,22. Выпуск новых синтезированных продуктов происходит независимо от выпуска SG. В совокупности эти посредники инициировать ранние и поздние фазы воспалительных и аллергических реакций. Таким образом, понимание механизмов, учитывающие MC активации и дегрануляции оба из теоретической и клинической импortance.

Трудность генетически манипулировать первичных и культурные МС препятствует попыткам выяснения механизмов, лежащих в основе MC дегрануляцию, которые были плохо решены. Чтобы преодолеть эту проблему, мы разработали на основе анализа репортерного СО-трансфекции линии тучных клеток слизистой оболочки, крысы базофильной лейкемии (RBL) -2H3 (отнесено здесь к RBL) или костного мозга, полученные МС (ВММС) ³⁰ с интересующего гена и нейропептида Y (NPY), слитый с мономерной RFP (MRFP), как SG репортера.

NPY Ранее было показано, воспроизводят поведение эндогенных маркеров SG в других системах. Кроме того, из-за флюоресценции MRFP является нечувствительным рН, выражение NPY-MRFP позволяет визуализировать кислотных ИК, а также количественную оценку с помощью экзоцитоза 96-луночные планшеты и устройства чтения флуоресценции пластины. Мы показали, что NPY-MRFP доставляется в кислых ИК в RBL-клеток и ВММС и высвобождается из клетокна регулируемом моды наряду с эндогенным SG груза (например, β-гексозаминидазы и серотонина) ^{30, 32.} Этот протокол обеспечивает изображения на основе методологии высокого разрешения, что позволяет скрининга генов, представляющих интерес для их фенотипических и функциональных влияния на характеристики SG и дегрануляции в RBL клеток ^32. В частности, этот протокол позволяет в режиме реального времени отслеживать MC ПГ и количественную оценку их области или размера тома, их номера, кинетики сборки, их движения по мобильному цитоскелета и их конечной слияния с плазматической мембраной при различных условиях. Например, сенсибилизации клеток с DNP-специфического IgE и запуск клетки с поливалентной Ag (DNP конъюгированный сывороточный альбумин) при различных возмущений (то есть, нокдаун генов, представляющих интерес, более экспрессии мас или мутантных генов, или фармакологических манипуляций) и по сравнению с контрольными клетками.