Indagare Mast Cellula secretoria Granuli; dal Biosintesi a Esocitosi

Mastociti (MC) sono cellule immunitarie che sono più noti per il loro coinvolgimento nelle reazioni allergiche e infiammatorie come l'artrite, l'asma, esofagite eosinofila, dermatite cronica e shock anafilattico ^1,2 così come altre patologie tra cui la malattia coronarica e ^3,5 cancro ^3,4. Inoltre, MCs svolgono un ruolo importante in innata e adattativa, sia in difesa dell'ospite contro i batteri e parassiti e dalla soppressione delle risposte immunitarie, ad esempio inducendo la tolleranza dell'organo trapiantato ^5,6.

MCs provengono dal midollo osseo, lo sviluppo di CD34 + / CD117 + cellule progenitrici pluripotenti ^7. Committed midollo osseo MC progenitori vengono rilasciati nel sangue e migrano nei tessuti periferici localizzative prevalentemente all'interno dei tessuti connettivi e superfici epiteliali ^8. Maturazione e differenziazione terminale vengono poi raggiunti sotto l'influenza of citochine all'interno l'ambiente circostante ^8,9.

MCs possono essere attivati ​​da un allergene (antigene, Ag), il cui incontro portato alla generazione di immunoglobulina E (IgE) tipo anticorpi. Il legame di tale IgE ai recettori FcεRI del MC, seguito da reticolazione di cellula legata IgE upon riesposizione allo stesso Ag, provoca l'aggregazione FcεRI e apertura di una cascata di segnalazione che culmina in degranulazione [recensione in ^10,11] . MCs sono attivati, indipendentemente da IgE, da neuropeptidi ^5,12, le tossine ^13, batterica e antigeni virali ^14,15, un numero di peptidi caricati positivamente collettivamente come secretagoghi di base, le cellule immunitarie e citochine ^{5,13,12,16 , 17.} MCs sono anche attivati ​​da molti dei propri mediatori rilasciati, che amplificano ulteriormente la risposta infiammatoria.

MCs sono confezionati con granuli di secreto (SGS) che contengono immunomediatori regolamentari, anche amine vasoattive, come l'istamina e la serotonina (in roditori), proteoglicani, proteasi, come chimasi e triptasi, fattore di crescita vascolare endoteliale e diverse citochine e chemochine ^8,9. Questi mediatori sono "pronti a partire" e una volta MCs sono attivati ​​da uno stimolo adeguato, questi mediatori vengono rilasciati dalle cellule di esocitosi regolata (degranulazione) in pochi secondi a minuti ^18,19. Questo evento iniziale è seguita dalla sintesi de novo e il rilascio di una vasta gamma di sostanze biologicamente potenti, tra metaboliti dell'acido arachidonico, più citochine e chemochine ^20,21,22. Rilascio di prodotti di nuova sintesi si verifica indipendentemente dal rilascio SG. Collettivamente, questi mediatori avviare prime e fase tardiva infiammatori e allergici risposte. Pertanto, la comprensione dei meccanismi che rappresentano per l'attivazione e la degranulazione MC sono entrambi di imp teorica e clinicaortance.

La difficoltà di manipolare geneticamente MCs primarie e coltivate ha ostacolato i tentativi di chiarire i meccanismi alla base MC degranulazione, che è rimasto mal risolti. Per ovviare a questo problema abbiamo sviluppato un giornalista saggio basato da co-trasfezione linea cellulare della mucosa mast, rat leucemia basofili (RBL) -2H3 (di seguito denominato RBL) o di midollo osseo derivate MCs (BMMCs) ³⁰ con un gene di interesse e neuropeptide Y (NPY) fusa RFP monomero (MRFP), come SG giornalista.

NPY è stato precedentemente dimostrato di ricapitolare il comportamento dei marcatori SG endogeni in altri sistemi. Inoltre, perché MRFP fluorescenza è pH insensibile, espressione di NPY-MRFP consente la visualizzazione delle SG acidi e valutazione quantitativa di esocitosi utilizzando piastre da 96 pozzetti e un lettore di fluorescenza. Abbiamo dimostrato che NPY-MRFP viene consegnato al SGS acide delle cellule RBL e BMMCs e viene rilasciato dalle cellulein modo regolato lungo il SG carico endogena (cioè, β-esosaminidasi e serotonina) ^{30, 32.} Questo protocollo fornisce una metodologia di imaging-based ad alta risoluzione che permette di geni di screening di interesse per la loro fenotipica e l'impatto funzionale su caratteristiche SG e degranulazione in cellule RBL ^32. In particolare, questo protocollo permette il monitoraggio in tempo reale di MC SGS e quantificazione della loro area o dimensioni del volume, il loro numero, la cinetica di assemblaggio, il loro movimento lungo il citoscheletro cellulare e la loro ultima fusione con la membrana plasmatica in condizioni diverse. Ad esempio, sensibilizzando le cellule con DNP-IgE specifiche e innescando le cellule con un Ag polivalente (DNP coniugato albumina sierica) in diverse perturbazioni (ad esempio, l'abbattimento dei geni di interesse, oltre l'espressione di geni wt o mutanti, o manipolazioni farmacologiche) e confronto alle cellule di controllo.