חוקר תא פיטום הפרשת הגרגרים; מיוסינתזה לExocytosis
Summary
המטרה של הפרוטוקול הנוכחי הייתה לפתח שיטה שתאפשר ניתוח הגנומי תפקודי של הפרשת תא פיטום. הפרוטוקול מבוסס על הערכה כמותית של שחרורו של גן כתב ניאון cotrasfected עם הגן של עניין וזמן אמת ניתוחים של המורפולוגיה של גרגר ההפרשה.
Abstract
תאי פיטום (MC) הם תאי הפרשה של המערכת החיסונית שלהשיג פונקציות הפיזיולוגיות ופתולוגיים שלהם על ידי שחרור מתווכים אלרגיים, דלקת וimmunoregulatory מראש יצר ומסונתזים חדש. המתווכים 'MCs משפיעים על רקמות ואיברים מרובים שהגיעו לשיא בתגובות אלרגיות וחיסוניות. הסינתזה, האחסון והשחרור של מתווכי MC קבוע בתקנות. המתווכים מראש יצר עמוסים בגרגירי cytoplasmic הפרשה (SG) שלהתמזג עם קרום הפלזמה ולשחרר את התוכן שלהם על ידי exocytosis המוסדר. אנו מציגים פרוטוקול, המבוסס על שיתוף הביטוי של גן של עניין עם גן כתב כי הוא ממוקד לSGS והוא שוחרר באופן מוסדר לצד מתווכי SG אנדוגני. הפרוטוקול מאפשר רזולוציה גבוהה ארבעה confocal ממדי ניתוחים של SGS MC וניטור ציר זמנם מbiogenesis לexocytosis מופעל. לפיכך, שימוש בפרוטוקול זה לסינון גנים של היתרest להשפעה פנוטיפי והפונקציונלית שלהם מאפשר פענוח המנגנונים המולקולריים השולטים בbiogenesis וexocytosis של SGS MC וזיהוי הרגולטורים מעורבים. וכך, תובנות נוספות המנגנונים התאיים שמהווים פונקצית MCs בבריאות ובמחלה צריכה להינתן.
Introduction
תאי פיטום (MC) הם תאים חיסוניים שידועות כי הם הטובים ביותר על מעורבותם בתגובות אלרגיות ודלקתיות כגון דלקת פרקים, אסטמה, דלקת ושט אאוזינופילית, דלקת עור כרונית והלם אנפילקטי 1,2 כמו גם פתולוגיות אחרות, כוללים מחלת לב כלילית 3.5 ו סרטן 3,4. בנוסף, מנחים ממלאים תפקידים חשובים בחסינות מולדת ובעלי כושר הסתגלות, גם בהגנת מארחת נגד חיידקים וטפילים ועל ידי דיכוי של מערכת חיסונית, למשל גרימת סובלנות שתל 5,6.
מנחי מקורן מח העצם, מתפתח מתאי CD34 pluripotent + / CD117 + 7. אבות MC מח עצם מחויב משתחררים לזרם הדם ונודדים לרקמות היקפי לוקליזציה בעיקר בתוך רקמות חיבור ומשטחי אפיתל 8. הבשלה והתמיינות מסוף מושגות סופו של דבר תחת השפעת of ציטוקינים בתוך 8,9 הסביבה שמסביב.
יכולים להיות מופעלים על ידי מנחים אלרגן (אנטיגן, Ag), מפגש שהסתיים בדור של E אימונוגלובולינים (IgE) הקלד נוגדנים. כריכה של IgE כזה לקולטנים FcεRI של MC, ואחריו cross-linking של תא קשור IgE על חשיפה מחדש לאותו Ag, תוצאות בצבירת FcεRI וייזום מפל איתות שמגיע לשיאו בdegranulation תא [שנסקרו ב10,11] . מנחים גם הופעלו, באופן בלתי תלוי IgE, על ידי נוירו 5,12, רעלי 13, חיידקים ואנטיגנים נגיפיים 14,15, מספר פפטידים בעלי מטען חשמלי חיוביים המכונים ביחד secretagogues הבסיסי, תאים וציטוקינים 5,13,12,16 חיסוניים , 17. מנחים גם מופעלים על ידי רב של המתווכים שלהם שוחררו, אשר עוד להגביר את התגובה הדלקתית.
מנחים הם ארוזים עם גרגירי הפרשה (SGS) המכילים חיסונימתווכי רגולציה, כוללים אמינים vasoactive, כגון היסטמין וסרוטונין (במכרסמים), proteoglycans, פרוטאזות, כגון chymase וtryptase, גורם גדילה של אנדותל כלי דם וכמה ציטוקינים וכמוקינים 8,9. מתווכים אלה הם "מוכנים ללכת" ופעם אחת MCs מופעל על ידי גירוי מתאים, מתווכים אלה משתחררים מהתאים על ידי exocytosis המוסדר (degranulation) בעניין של שניות עד דקות 18,19. אירוע ראשוני זה ואחריו סינתזת דה נובו ושחרורו של מגוון רחב של חומרים ביולוגיים חזקים, כוללים מטבוליטים הארכידונית חומצה, ציטוקינים מרובים וכמוקינים 20,21,22. שחרור של מוצרים מסונתזים חדש מתרחש באופן עצמאי של שחרור SG. באופן קולקטיבי, מתווכים אלה ליזום מוקדמים ושלב מאוחר דלקתי ואלרגי תגובות. לכן, הבנת המנגנונים המהווים הפעלת MC וdegranulation שניהם של שד תיאורטי וקליניortance.
הקושי לתמרן גנטי MCs הראשוני והתרבותי שהקשה על הניסיונות להבהיר את המנגנונים העומדים בבסיס degranulation MC, שנשאר גרוע נפתר. מנחים כדי להתגבר על בעיה זו פיתחנו מבוסס assay כתב ידי, לוקמיה basophilic עכברוש קו תא פיטום ברירית transfecting-שיתוף (RBL) -2H3 (המכונים במסמך זה כלRBL) או מח עצם נגזרים (BMMCs) 30 עם גן של עניין ו Neuropeptide Y (NPY) התמזג RFP monomeric (mRFP), ככתב SG.
NPY הוצג בעבר לשחזר את התנהגותם של סמני SG אנדוגני במערכות אחרות. יתר על כן, מכיוון שקרינת mRFP הוא pH רגיש, ביטוי של NPY-mRFP מאפשר הדמיה של SGS חומציים כמו גם הערכה כמותית של exocytosis באמצעות 96-גם צלחות וקורא צלחת הקרינה. הראינו כי NPY-mRFP מועבר לSGS חומצי של תאי RBL וBMMCs והוא שוחרר מהתאיםבאופן מוסדר לצד מטען SG אנדוגני (כלומר, β-hexosaminidase וסרוטונין) 30, 32. פרוטוקול זה מספק מתודולוגיה המבוססת על הדמיה ברזולוציה גבוהה המאפשרת גני הקרנה של עניין לפנוטיפי שלהם והשפעה תפקודית על מאפייני SG וdegranulation בתאי RBL 32. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מאפשר מעקב בזמן אמת של MC SGS וכימות של האזור שלהם או גודל נפח, מספרם, קינטיקה של הרכבה, תנועתם לאורך שלד תא התא וההיתוך האולטימטיבי שלהם עם קרום הפלזמה בתנאים שונים. לדוגמא, רגישות התאים עם DNP-הספציפי IgE ומפעיל את התאים עם Ag רב-ערכי (אלבומין בסרום מצומדות DNP) תחת הפרעות שונות (כלומר, מציאה של גנים של עניין, על ביטוי של גני WT או מוטציה, או מניפולציות תרופתיות) ו השוואה לשלוט תאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מתארים אסטרטגיה חדשנית המשלבת כימות של exocytosis המנחים וארבעה (x, y, z, t) quantifications ממד על ידי הדמיה תלת-ממדית-פקע זמן של SGS בתאים חיים באמצעות גן מדווח לexocytosis. טכניקה זו מאפשרת הקרנה של משפחות של חלבונים להשפעתם על תפקוד MC כגון SGS הניטור מתחילות כבר ביציאתם מGolgi דרך התבגרו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד"ר א Ashery על המתנה של NPY-mRFP cDNA. אנו מודים בני הזוג. MJ Kofron, ל 'מיטלמן, מ' שרבני, וי 'זילברשטיין לסיוע לא יסולא בפז עם מיקרוסקופ ותמונת ניתוחים. כמו כן, אנו מודים לד"ר יוסף אורלי לקריאה ביקורתית של כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהקרן הלאומי למדע, שנוסד על ידי האקדמיה הלאומית הישראלית למדעים (1139-1112 לRS-E.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6046-500ML | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | GE health care Life sciences | SH30071.01 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | ||
| Cellulose acetate membrane, pore size 0.22 μm | Sigma-Aldrich | CLS430769-1EA | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Life technologies | R001100 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PIPES dipotassium salt | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Calcium acetate hydrate | Sigma-Aldrich | 114460-21-8 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate) | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| 4 mm electroporation cuvettes | cell projects | EP-104 | |
| GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER & CAPACITANCE | Bio rad | ||
| Chambered coverglass | Thermo scientific | 155411 | |
| 24 well, flat bottom | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
| Corning 96 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3367 or CLS390 | |
| 96 well plate fluorescence reader- Infinite 200 | Tecan | ||
| Calcium ionophore A23187 | Sigma-Aldrich | C7522 | Avoid from direct light exposure |
| 12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA) | Calbiochem | P3766 | |
| anti-DNP monoclonal IgE | Sigma-Aldrich | D8406 | |
| DNP-BSA/ DNP-HAS | Sigma-Aldrich | A6661 | Avoid from direct light exposure |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Confocal fluorescent microscope: | |||
| Zeiss LSM 510 | |||
| Leica | SP5 | ||
| Nikon A1 inverted | |||
| Imaris software | BITLANE | ||
| Microsoft exel or Prism or other analyses software | |||
| Other reagent: | |||
| Magnesium Chloride | MERK | 5833 | |
| Sodium chloride | MERK | 6404 | |
| Calcium chloride | MERK | 2382 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Glucose | BDH Laboratories | 284515V | |
| Monosodium phosphate | MERK | 5345 | |
| Sterile water |
References
- Abonia, J. P., et al. Involvement of mast cells in eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 126 (1), 140-149 (2010).
- Galli, S. J., Tsai, M. Mast cells in allergy and infection: versatile effector and regulatory cells in innate and adaptive immunity. Eur J Immunol. 40 (7), 1843-1851 (2010).
- Ribatti, D., Crivellato, E. The controversial role of mast cells in tumor growth. International Review of Cell and Molecular Biology. 275, 89-131 (2009).
- Ribatti, D., Crivellato, E. Mast cells, angiogenesis and cancer. Adv Exp Med Biol. 716, 270-288 (2011).
- Tsai, M., Grimbaldeston, M., Galli, S. J. Mast cells and immunoregulation/immunomodulation. Adv Exp Med Biol. 716, 186-211 (2011).
- Vries, V. C., Noelle, R. J. Mast cell mediators in tolerance. Curr Opin Immunol. 22 (5), 643-648 (2010).
- Kirshenbaum, A. S., et al. Demonstration that human mast cells arise from a progenitor cell population that is CD34(+), c-kit(+), and expresses aminopeptidase N (CD13). Blood. 94 (7), 2333-2342 (1999).
- Metcalfe, D. D., Baram, D., Mekori, Y. A. Mast cells. Physiol Rev. 77 (4), 1033-1079 (1997).
- Gilfillan, A. M., Austin, S. J., Metcalfe, D. D. Mast cell biology: introduction and overview. Adv Exp Med Biol. 716, 2-12 (2011).
- Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. J Allergy Clin Immunol. 117 (6), 1214-1225 (2006).
- Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 117 (6), 1214 (2006).
- Lagunoff, D., Martin, T. W., Read, G. Agents that release histamine from mast cells. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 331-351 (1983).
- Depinay, N., Hacini, F., Beghdadi, W., Peronet, R., Mecheri, S. Mast cell-dependent down-regulation of antigen-specific immune responses by mosquito bites. J Immunol. 176 (7), 4141-4146 (2006).
- Abel, J., et al. Staphylococcus aureus evades the extracellular antimicrobial activity of mast cells by promoting its own uptake. J Innate Immun. 3 (5), 495-507 (2011).
- Avila, M., Gonzalez-Espinosa, C. Signaling through Toll-like receptor 4 and mast cell-dependent innate immunity responses. IUBMB Life. 63 (10), 873-880 (2011).
- Novak, N., Bieber, T., Peng, W. M. The immunoglobulin E-Toll-like receptor network. Int Arch Allergy Immunol. 151 (1), 1-7 (2010).
- Rudich, N., Ravid, K., Sagi-Eisenberg, R. Mast cell adenosine receptors function: a focus on the a3 adenosine receptor and inflammation. Front Immunol. 3, 134 (2012).
- Theoharides, T. C., Kempuraj, D., Tagen, M., Conti, P., Kalogeromitros, D. Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation. Immunol Rev. 217, 65-78 (2007).
- Caughey, G. H. Mast cell proteases as protective and inflammatory mediators. Adv Exp Med Biol. 716, 212-234 (2011).
- Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
- Metz, M., Maurer, M. Mast cells–key effector cells in immune responses. Trends Immunol. 28 (5), 234-241 (2007).
- Gordon, J. R., Burd, P. R., Galli, S. J. Mast cells as a source of multifunctional cytokines. Immunol Today. 11 (12), 458-464 (1990).
- Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
- Stenmark, H., et al. Inhibition of rab5 GTPase activity stimulates membrane fusion in endocytosis. EMBO J. 13 (6), 1287-1296 (1994).
- Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).
