Untersuchung Mast Cell Sekretgranula; von Biosynthese zu Exocytosis
Summary
Das Ziel des vorliegenden Protokolls war es, eine Methode, die funktionelle Genomanalysen von Mastzellen Sekretion ermöglichen entwickeln wird. Das Protokoll basiert auf einer quantitativen Beurteilung der Freisetzung eines fluoreszierenden Reporter-Gen mit dem Gen von Interesse und den Echtzeit cotrasfected Analysen der sekretorischen Granula Morphologie.
Abstract
Mastzellen (MC) sind sekretorische Zellen des Immunsystems, die den physiologischen und pathologischen Funktionen durch Lösen vorgeformt und neu synthetisierten allergischen, entzündlichen und immunMediaToren erreichen. MCs "Mediatoren beeinflussen mehrere Gewebe und Organe ihren Höhepunkt in Allergien und Immunreaktionen. Die Synthese, Speicherung und Freisetzung der MC Mediatoren sind stark reguliert. Die vorgeformten Mediatoren in zytoplasmatischen sekretorischen Granula (SG), die mit der Plasmamembran verschmelzen und ihr Inhalt durch regulierte Exozytose verpackt. Wir stellen ein Protokoll, bezogen auf die Co-Expression eines Gens von Interesse mit einem Reportergen, das auf das SGs richtet ist und in einer geregelten Art und Weise entlang der endogenen Mediatoren freigesetzt SG. Das Protokoll ermöglicht hochauflösende vierdimensionalen konfokalen Analysen des MC SGs und Überwachung der Zeitleiste aus Biogenese ausgelöst Exozytose. Somit kann unter Verwendung dieses Protokolls zum Screenen Genen interest für ihre phänotypische und funktionelle Auswirkungen ermöglicht die Entschlüsselung der molekularen Mechanismen, die Biogenese und Exozytose des MC SGs zu regieren und die Ermittlung der Regulierungsbehörden beteiligt. Dabei sollten weitere Einblicke in die zellulären Mechanismen, die für die MCs Funktion in Gesundheit und Krankheit Konto zur Verfügung gestellt werden.
Introduction
Mastzellen (MC) sind Immunzellen, die am besten für ihre Beteiligung an allergischen und entzündlichen Reaktionen wie Arthritis, Asthma, eosinophile Ösophagitis, chronische Hautentzündung und anaphylaktischer Schock 1,2 sowie andere Erkrankungen, einschließlich koronarer Herzkrankheit 3,5 und bekannt sind, Krebs 3,4. Darüber hinaus spielen MCs eine wichtige Rolle bei angeborenen und erworbenen Immunität, die beide in der Wirtsabwehr gegen Bakterien und Parasiten und durch Unterdrückung von Immunreaktionen, zum Beispiel induziert Transplantattoleranz 5,6.
MCs stammen aus dem Knochenmark, die Entwicklung von CD34 + / CD117 + pluripotenten Vorläuferzellen 7. Engagierte Knochenmarksvorläuferzellen MC sind in die Blutbahn und wandern in den peripheren Geweben zu lokalisieren überwiegend im Bindegewebe und Epithel-Oberflächen 8. Reifung und terminale Differenzierung werden schließlich unter dem Einfluss o erreichtf Zytokine innerhalb der umgebenden Milieu 8,9.
MCs kann durch ein Allergen (Antigen, Ag), deren Zusammentreffen führte zur Erzeugung von Immunglobulin E (IgE) Antikörper vom Typ aktiviert werden. Die Bindung eines solchen IgE an den MC FcsRI Rezeptoren, gefolgt von Vernetzen des zellgebundenen IgE bei erneutem Kontakt zu derselben Ag, Ergebnis in FcsRI Aggregation und Einleitung einer Signalkaskade, die in Mastzelldegranulation gipfelt [in 10,11 Bewertung] . MCs werden ebenfalls aktiviert, unabhängig von IgE durch Neuropeptide 5,12, Toxine 13, bakterielle und virale Antigene, 14,15, eine Reihe von positiv geladenen Peptide kollektiv als Grund Sekretagoga, Immunzellen und Zytokinen 5,13,12,16 bezeichnet , 17. MCs werden auch von vielen ihrer eigenen freigesetzten Mediatoren, die weiter verstärken die entzündliche Reaktion aktiviert.
MCs mit sekretorischen Granula (DMS), die Immun enthalten verpacktRegelungsmediatoren einschließlich vasoaktive Amine, wie Histamin und Serotonin (bei Nagern), Proteoglykane, Proteasen, wie Chymosin und Tryptase, vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor und verschiedene Zytokine und Chemokine 8,9. Diese Mediatoren sind "ready to go" und einmal MCs werden durch einen geeigneten Stimulus aktiviert werden diese Mediatoren aus den Zellen durch Exozytose (Degranulation) in einer Angelegenheit von Sekunden bis Minuten 18,19 freigegeben. Diese erste Veranstaltung wird von der De-novo-Synthese und Freisetzung von einer großen Auswahl an biologisch wirksamer Stoffe, einschließlich Arachidonsäure-Metaboliten, mehrere Zytokine und Chemokine 20,21,22 gefolgt. Freisetzung von neu synthetisierten Produkte erfolgt unabhängig von SG-Release. Zusammengenommen sind diese Mediatoren initiieren frühen und späten Phase entzündliche und allergische Reaktionen. Daher Verständnis der Mechanismen Anteil von MC-Aktivierung und Degranulation sind beide von theoretischen und klinischen importance.
Die Schwierigkeit genetisch zu manipulieren primären und kultiviert MCs hat die Versuche, die Mechanismen MC Degranulation zugrunde, die schlecht aufgelöste blieb Aufklärung behindert. Um dieses Problem zu überwinden, haben wir ein Reporter basierten Assay durch Co-Transfizieren des Schleimhaut-Mastzelllinie, Ratte Basophilenleukämie entwickelt (RBL) -2H3 (hierin als RBL bezeichnet) oder Knochenmark-abgeleitete (MCS BMMCs) 30 mit einem Gen von Interesse und Neuropeptid Y (NPY), fusioniert an monomeren RFP (mRFP) als SG Reporter.
NPY wurde zuvor gezeigt, daß das Verhalten des endogenen SG Marker in anderen Systemen zu rekapitulieren. Da außerdem mRFP Fluoreszenz pH unempfindlich Expression von NPY-mRFP ermöglicht die Visualisierung der sauren SGs sowie quantitative Beurteilung der Exozytose durch Verwendung von 96-Well-Platten und einem Fluoreszenz-Plattenlesegerät. Wir haben gezeigt, dass NPY-mRFP ist mit den sauren SGs von RBL-Zellen und BMMCs geliefert und wird aus den Zellen freigesetztin einer regulierten Weise neben dem endogenen SG Ladung (dh β-Hexosaminidase und Serotonin) 30, 32. Dieses Protokoll bietet eine hochauflösende Bildgebung basierende Methodik, die Screening Gene von Interesse für ihre phänotypische und funktionelle Auswirkungen auf SG Eigenschaften und Degranulation in RBL-Zellen 32 erlaubt. Insbesondere ermöglicht dieses Protokoll in Echtzeit-Verfolgung von MC SGs und Quantifizierung von deren Fläche oder Volumen Größe, ihrer Zahl, Kinetik der Montage, ihre Bewegung entlang der Zelle Zytoskeletts und ihre endgültige Fusion mit der Plasmamembran unter verschiedenen Bedingungen. Beispielsweise Sensibilisierung der Zellen mit DNP-spezifische IgE und Triggerung der Zellen mit einer multivalenten Ag (DNP konjugiert Serumalbumin) unter verschiedenen Störungen (dh Knockdown von Genen von Interesse, über die Expression von wt oder mutierten Genen oder pharmakologischen Manipulationen) und im Vergleich zu Kontrollzellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir beschreiben eine innovative Strategie, die Quantifizierung von MCs Exozytose und vier (x, y, z, t) Dimension Quantifizierungen kombiniert mit zeitversetzt dreidimensionale Abbildung der SGs in lebenden Zellen mit einem Reportergen zur Exozytose. Diese Technik ermöglicht Screening von Proteinfamilien auf ihre Auswirkungen auf MC-Funktion wie die Überwachung SGs bereits ab ihrem Austritt aus dem Golgi durch ihre Reifung, Erwerb von Exozytose Kompetenz und Degranulation. Die Kombination von Messungen der Exozytose mi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. U. Ashery für das Geschenk des NPY-mRFP cDNA. Wir danken Drs. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani und Y. Zilberstein für wertvolle Unterstützung mit Mikroskopie und Bildanalyse. Wir danken auch Dr. Joseph Orly für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der Israel Science Foundation, durch die Israel Akademie der Wissenschaften gegründet, unterstützt (1139-1112 zu RS-E.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6046-500ML | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | GE health care Life sciences | SH30071.01 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | ||
| Cellulose acetate membrane, pore size 0.22 μm | Sigma-Aldrich | CLS430769-1EA | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Life technologies | R001100 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PIPES dipotassium salt | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Calcium acetate hydrate | Sigma-Aldrich | 114460-21-8 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate) | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| 4 mm electroporation cuvettes | cell projects | EP-104 | |
| GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER & CAPACITANCE | Bio rad | ||
| Chambered coverglass | Thermo scientific | 155411 | |
| 24 well, flat bottom | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
| Corning 96 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3367 or CLS390 | |
| 96 well plate fluorescence reader- Infinite 200 | Tecan | ||
| Calcium ionophore A23187 | Sigma-Aldrich | C7522 | Avoid from direct light exposure |
| 12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA) | Calbiochem | P3766 | |
| anti-DNP monoclonal IgE | Sigma-Aldrich | D8406 | |
| DNP-BSA/ DNP-HAS | Sigma-Aldrich | A6661 | Avoid from direct light exposure |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Confocal fluorescent microscope: | |||
| Zeiss LSM 510 | |||
| Leica | SP5 | ||
| Nikon A1 inverted | |||
| Imaris software | BITLANE | ||
| Microsoft exel or Prism or other analyses software | |||
| Other reagent: | |||
| Magnesium Chloride | MERK | 5833 | |
| Sodium chloride | MERK | 6404 | |
| Calcium chloride | MERK | 2382 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Glucose | BDH Laboratories | 284515V | |
| Monosodium phosphate | MERK | 5345 | |
| Sterile water |
References
- Abonia, J. P., et al. Involvement of mast cells in eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 126 (1), 140-149 (2010).
- Galli, S. J., Tsai, M. Mast cells in allergy and infection: versatile effector and regulatory cells in innate and adaptive immunity. Eur J Immunol. 40 (7), 1843-1851 (2010).
- Ribatti, D., Crivellato, E. The controversial role of mast cells in tumor growth. International Review of Cell and Molecular Biology. 275, 89-131 (2009).
- Ribatti, D., Crivellato, E. Mast cells, angiogenesis and cancer. Adv Exp Med Biol. 716, 270-288 (2011).
- Tsai, M., Grimbaldeston, M., Galli, S. J. Mast cells and immunoregulation/immunomodulation. Adv Exp Med Biol. 716, 186-211 (2011).
- Vries, V. C., Noelle, R. J. Mast cell mediators in tolerance. Curr Opin Immunol. 22 (5), 643-648 (2010).
- Kirshenbaum, A. S., et al. Demonstration that human mast cells arise from a progenitor cell population that is CD34(+), c-kit(+), and expresses aminopeptidase N (CD13). Blood. 94 (7), 2333-2342 (1999).
- Metcalfe, D. D., Baram, D., Mekori, Y. A. Mast cells. Physiol Rev. 77 (4), 1033-1079 (1997).
- Gilfillan, A. M., Austin, S. J., Metcalfe, D. D. Mast cell biology: introduction and overview. Adv Exp Med Biol. 716, 2-12 (2011).
- Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. J Allergy Clin Immunol. 117 (6), 1214-1225 (2006).
- Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 117 (6), 1214 (2006).
- Lagunoff, D., Martin, T. W., Read, G. Agents that release histamine from mast cells. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 331-351 (1983).
- Depinay, N., Hacini, F., Beghdadi, W., Peronet, R., Mecheri, S. Mast cell-dependent down-regulation of antigen-specific immune responses by mosquito bites. J Immunol. 176 (7), 4141-4146 (2006).
- Abel, J., et al. Staphylococcus aureus evades the extracellular antimicrobial activity of mast cells by promoting its own uptake. J Innate Immun. 3 (5), 495-507 (2011).
- Avila, M., Gonzalez-Espinosa, C. Signaling through Toll-like receptor 4 and mast cell-dependent innate immunity responses. IUBMB Life. 63 (10), 873-880 (2011).
- Novak, N., Bieber, T., Peng, W. M. The immunoglobulin E-Toll-like receptor network. Int Arch Allergy Immunol. 151 (1), 1-7 (2010).
- Rudich, N., Ravid, K., Sagi-Eisenberg, R. Mast cell adenosine receptors function: a focus on the a3 adenosine receptor and inflammation. Front Immunol. 3, 134 (2012).
- Theoharides, T. C., Kempuraj, D., Tagen, M., Conti, P., Kalogeromitros, D. Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation. Immunol Rev. 217, 65-78 (2007).
- Caughey, G. H. Mast cell proteases as protective and inflammatory mediators. Adv Exp Med Biol. 716, 212-234 (2011).
- Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
- Metz, M., Maurer, M. Mast cells–key effector cells in immune responses. Trends Immunol. 28 (5), 234-241 (2007).
- Gordon, J. R., Burd, P. R., Galli, S. J. Mast cells as a source of multifunctional cytokines. Immunol Today. 11 (12), 458-464 (1990).
- Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
- Stenmark, H., et al. Inhibition of rab5 GTPase activity stimulates membrane fusion in endocytosis. EMBO J. 13 (6), 1287-1296 (1994).
- Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).
