Listeria monocytogenes Kullanarak Enfekte Farelerde Kültür ve Kalp Kolonizasyonunda Kardiyak Hücrelerin Bakteriyel İstilasının Değerlendirilmesi
Summary
Listeria monocytogenes gebelerde fetal enfeksiyonlara ve duyarlı popülasyonlarda menenjite neden olur. Bakterilerin subpopulasyonları kalp dokusunu kolonize ederek hastalarda ve laboratuvar hayvanlarında miyokarditlere neden olabilir. Burada L. monocytogenes kardiyak hücre invazyonunun in vitro ve enfekte hayvanlarda kardiyak kolonizasyonun nasıl değerlendirileceğini açıklayan bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Listeria monocytogenes, immün sistemi baskılanmış hastalarda, yaşlılarda ve hamile kadınlarda ciddi invaziv enfeksiyonlara neden olabilecek gram pozitif bir fakülte içi patojendir. İnsanlarda listeriosis’in en yaygın belirtileri menenjit, ensefalit ve fetal kürtajdır. İnvaziv L. monocytogenes enfeksiyonunun önemli ama çok daha az belgelenmiş bir sekel kalbi içerir. Kardiyak hastalıktan ölüm oranı tedaviye rağmen% 35’e kadar olabilir, ancak L. monocytogenes kardiyak dokunun kolonizasyonu ve bunun sonucunda ortaya çıkan patolojileri hakkında çok az şey bilinmektedir. Ek olarak, son zamanlarda L. monocytogenes’in subpopulasyonlarının kalp dokusu içinde istila etme ve büyüme kapasitesine sahip olduğu ortaya çıktı. Bu protokol, L. monocytogenes izolatlarının kardiyotropizmini değerlendirmek için kullanılabilecek in vitro ve in vivo yöntemleri ayrıntılı olarak açıklar. Doku kültüründe H9c2 sıçan kardiyak miyoblastların enfeksiyonu ve enfekte farelerin kalplerinin bakteriyel kolonizasyonunun belirlenmesi için yöntemler sunulmaktadır. Bu yöntemler sadece enfekte hayvanlarda kardiyak dokuyu kolonize etme potansiyeline sahip suşları tanımlamak için yararlı değildir, aynı zamanda kalp hücresi istilasını artırmaya ve / veya kalp patolojislerindeki değişiklikleri yönlendirmeye yarayan bakteriyel gen ürünlerinin tanımlanmasını da kolaylaştırabilir. Bu yöntemler ayrıca birden fazla L. monocytogenes suşu arasında kardiyotropizmin doğrudan karşılaştırılmasına da neden olabilir.
Introduction
Listeria monocytogenes, yaşlılar, hamile kadınlar, HIV/ AIDS’li kişiler ve kemoterapi alan kişiler de dahil olmak üzere duyarlı popülasyonlarda ağır hastalığa neden olabilecek gram-pozitif hücre içi patojendir1. Bu popülasyonlardaki enfeksiyon sıklıkla kontamine gıda ürünlerinin yutulması sonucu ortaya çıkan bir şeydir ve çoğu enfeksiyon büyük ölçekli gıda kaynaklı salgınlarla ilişkilidir2,3. İnsanlarda ve diğer memelilerde, L. monocytogenes ince bağırsağın epitel sınırından geçiş yapabilir ve daha sonra karaciğere taşınabilir4,5. Hayvan modelleri, yutulan bakterilerin bağırsak villi içinde çoğaldığını ve portal damardan karaciğere geçtiğini veya mezenterik lenf düğümleri aracılığıyla kan akışına yayıldığını, karaciğere hematojen yayılmasına yol açarak6,7dalağı olduğunu göstermektedir. Karaciğer ve dalakta, bakteri hem profesyonel fagositlere hem de yerleşik parenkimal hücrelere alıma aracılık edebilir ve bu organlarda hızla enfeksiyonlar oluşturur. Bakteri yükü arttıkça, çok sayıda bakteri kana geri dağılır ve burada merkezi sinir sistemi ve plasenta (varsa) dahil olmak üzere hassas dokuları daha fazla kolonileştirebilir. Bu bölgelerin kolonizasyonu, menenjit, ensefalit ve fetal kürtaj dahil olmak üzere insanlarda listeriosis’in en yaygın belirtilerini önler2.
L. monocytogenes’in seçilmiş alt nüfuslarının son zamanlarda kardiyak doku içinde istila etme ve çoğaltma kapasitesi gelişmiş olduğu gösterilmiştir8. Kalp tutulumunun belirtileri çeşitlidir ve endokardit ve perikarditten iletim anormallikleri9-13ile tamamlanan fulminant miyokarditlere kadar değişir. Yılda L. monocytogenes kardiyak olguların genel sayısı düşüktür, ancak enfeksiyonun bu yönü genellikle iyi tanınmadığı için tahmin edilebilir. Kalbin patojenler tarafından kolonizasyonu genellikle önceden var olan valvüler hasar veya yapay kalp kapakçıkları gibi konak yatkınlıkları gerektirir. Bununla birlikte, herhangi bir kardiyak hasar ve / veya anormallik yokluğunda enfekte hayvanların kalplerini kolonileştirme kapasiteleri ile dikkat çeken L. monocytogenes izoleleri vardır8.
Burada, canlı hayvan enfeksiyonlarının yanı sıra doku kültüründe istila tahlilleri kullanılarak enfekte hayvanlar içindeki kardiyak dokunun bakteriyel kolonizasyonunu değerlendirmek için in vitro ve in vivo yöntemler açıklanmaktadır. Bu yöntemler sadece enfekte hayvanlarda kardiyak dokuyu kolonize etme potansiyeline sahip suşları tanımlamak için değil, aynı zamanda kardiyak hücre istilasını artırmaya ve / veya kalp patolojisinde değişikliklere neden olan bakteriyel gen ürünlerinin tanımlanması için de yararlı olmalıdır. Bu yöntemler kardiyotropinin birden fazla suş arasında karşılaştırılmasına kolaylaşır. Burada açıklanan yöntemler için L. monocytogenes 10403S kardiyotropik olmayan bir suşun iyi çalışılmış bir temsilcisi olarak, klinik izolat 07PF0776 ise kardiyotropik bir suşun temsili bir örneği olarak kullanılmaktadır. Bu iki suş, in vitro kardiyak hücrelerin bakteriyel istilası ve enfekte farelerin kalplerinin kolonizasyonu için bir karşılaştırma sağlamak için seçildi vivo. İzole 07PF0776, HIV+ hastasında ölümcül aritmiye neden olan bir müdahale apsesinden kurtarılan klinik birizoledir 8. L. monocytogenes izolatları virülans potansiyellerinde değişebilir ve Listeria’nın bağışıklık baskılayıcı ve hamile kadınları enfekte etme eğilimi göz önüne alındığında, bu popülasyonlardaki kişiler farklı klinik izolatları değerlendirirken dikkatli olmalıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
L. monocytogenes, bir dizi farklı hastalık tezahürüne neden olabilecek yaygın ve iyi karakterize bir insan patojenidir15. Bakteri daha önce, sırasıyla merkezi sinir sistemine ve gelişmekte olan fetüse ulaşmak ve kolonileştirmek için kan-beyin bariyeri ve plasental-fetal bariyerler gibi bariyerler arasında geçiş yapabilme yeteneği ile tanımlanmıştır. Organizmanın bu dokuları kolonize etme in vivo yeteneği genellikle hedeflenen organları oluşturan kültürdeki temsili …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Halk Sağlığı Servisi tarafından AI41816 ve AI099339 (N.E.F.) ve NIAID’den F31AI094886-01 (P.D.M.) tarafından desteklendi. İçerikler yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka finansman kaynaklarının resmi görüşlerini temsil etmez.
Materials
| Difco | BHI Broth Base | 237200 | 2KG of Brain Heart Infusion powder (without agar) |
| Difco | Agar | 214510 | 2KG of Granulated Agar |
| Difco | BHI Agar | 241810 | 2KG of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar |
| in vitrogen | LB Broth Base | 12975-084 | 2KG of Luria Broth Base Powder (without agar) |
| Fisher | Glass Coverslips | 12-545-80 | 12mm glass coverslips |
| Falcon | 24-well Tissue Culture Plate | 35-3047 | 24 Well, Plasma-treated Tissue Culture Plate |
| Falcon | 14mL Polystyrene tube | 352051 | 14mL Polystyrene tubes |
| Falcon | 96-well U-bottom plate | 35-3077 | Non-tissue culture treated 96-well plate |
| Corning | 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X) | 25-052-CI | Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture |
| Corning | DMEM (High glucose, high pyruvate) | 15-013-CU | DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics |
| Corning | Pen/Strep/Glut Solution | 30-009-CI | Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture |
| Corning | Gentamicin | 30-005-CR | 50mg/mL Stock solution of Gentamicin for tissue culture |
| Cellgro (Corning) | L-Glutamine | 25005197 | Stock L-glutamine solution without antibiotics |
| Denville | 75cm^2 Flask | T1225 | 75cm^2 tissue culture treated flask |
| Denville | 1.5mL microcentrifuge tubes | 2013004 | 1.5mL microcentrifuge tubes |
| ATCC | H9c2 Cardiac Myoblasts | CRL-1446 | Rat cardiac myoblasts |
| Hyclone | Fetal Bovine Serum | SH30070.63 | Fetal Bovine Serum |
References
- Freitag, N. E. From hot dogs to host cells: how the bacterial pathogen Listeria monocytogenes regulates virulence gene expression. Future Microbiol. 1, 89-101 (2006).
- Drevets, D. A., Bronze, M. S. Listeria monocytogenes: epidemiology, human disease, and mechanisms of brain invasion. FEMS Immunol Med Microbiol. 53, 151-165 (2008).
- Farber, J. M., Peterkin, P. I. Listeria monocytogenes. a food-borne pathogen. Microbiol. Rev. 55, 476-511 (1991).
- Lecuit, M. Understanding how Listeria monocytogenes targets and crosses host barriers. Clin Microbiol Infect. 11, 430-436 (2005).
- Lecuit, M. Human listeriosis and animal models. Microbes Infect. 9, 1216-1225 (2007).
- Bou Ghanem, E. N., et al. InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice. PLoS Pathog. 8, e1003015 (2012).
- Melton-Witt, J. A., Rafelski, S. M., Portnoy, D. A., Bakardjiev, A. I. Oral infection with signature-tagged Listeria monocytogenes reveals organ-specific growth and dissemination routes in guinea pigs. Infect Immun. 80, 720-732 (2012).
- Alonzo, F., Bobo, L. D., Skiest, D. J., Freitag, N. E. Evidence for subpopulations of Listeria monocytogenes with enhanced invasion of cardiac cells. J Med Microbiol. , (2011).
- Adler, A., et al. Inflammatory pseudotumor of the heart caused by Listeria monocytogenes infection. J Infect. 58, 161-163 (2009).
- Antolin, J., Gutierrez, A., Segoviano, R., Lopez, R., Ciguenza, R. Endocarditis due to Listeria: description of two cases and review of the literature. Eur J Intern Med. 19, 295-296 (2008).
- Brouqui, P., Raoult, D. Endocarditis due to rare and fastidious bacteria. Clin Microbiol Rev. 14, 177-207 (2001).
- Brusch, J. L. Cardiac infections in the immunosuppressed patient. Infect Dis Clin North Am. 15, 613-638 (2001).
- McCue, M. J., Moore, E. E. Myocarditis with microabscess formation caused by Listeria monocytogenes associated with myocardial infarct. Hum Pathol. 10, 469-472 (1979).
- Menard, C., et al. Modulation of L-type calcium channel expression during retinoic acid-induced differentiation of H9C2 cardiac cells. J Biol Chem. 274, 29063-29070 (1999).
- Czuprynski, C. J. Listeria monocytogenes: silage, sandwiches and science. Anim Health Res Rev. 6, 211-217 (2005).
- Grundler, T., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
- Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes. PLoS Pathog. 7, e1002005 (2011).
- Kimes, B. W., Brandt, B. L. Properties of a clonal muscle cell line from rat heart. Experimental cell research. 98, 367-381 (1976).
- McMullen, P. D., et al. Genome sequence of Listeria monocytogenes 07PF0776, a cardiotropic serovar 4b strain. J Bacteriol. 194, 3552 (2012).
