Summary

Оценка бактериального вторжения сердечных клеток в культуре и колонизации сердца у инфицированных мышей с использованием листерий моноцитогенов

Published: May 27, 2015
doi:

Summary

Листерии моноцитогенов вызывает инфекции плода у беременных женщин и менингит в восприимчивых популяциях. Субпопуляции бактерий могут колонизировать сердечную ткань, вызывая миокардит у пациентов и лабораторных животных. Здесь мы представляем протокол, который описывает, как оценить L. monocytogenes сердечной клетки вторжения в пробирке и сердечной колонизации у инфицированных животных.

Abstract

Listeria monocytogenes является грамположительным внутриклеточным патогеном, который способен вызывать серьезные инвазивные инфекции у пациентов с ослабленным иммунитетом, пожилых людей и беременных женщин. Наиболее распространенными проявлениями листериоза у людей являются менингит, энцефалит и аборты плода. Значительное, но гораздо менее документально продолжение инвазивных L. monocytogenes инфекции включает в себя сердце. Уровень смертности от сердечно-сосудистых заболеваний может быть до 35%, несмотря на лечение, однако очень мало известно о L. monocytogenes колонизации сердечной ткани и ее результатных патологий. Кроме того, в последнее время стало очевидно, что субпопуляции L. monocytogenes имеют повышенную способность вторгаться и расти в сердечной ткани. Этот протокол подробно описывает в пробирке и in vivo методы, которые могут быть использованы для оценки кардиотропизма Изолятов L. monocytogenes. Представлены методы заражения крысиных миобластов H9c2 в культуре тканей, а также для определения бактериальной колонизации сердец инфицированных мышей. Эти методы полезны не только для выявления штаммов с потенциалом колонизации сердечной ткани у инфицированных животных, но также могут способствовать выявлению бактериальных генных продуктов, которые служат для повышения вторжения сердечной клетки и / или диск изменения в патологии сердца. Эти методы также обеспечивают прямое сравнение кардиотропизма между несколькими штаммами L. monocytogenes.

Introduction

Листерия моноцитогенов является грамположительных внутриклеточных патогенов, способных вызвать тяжелые заболевания в восприимчивых групп населения, в том числе пожилых людей, беременных женщин, людей с ВИЧ / СПИДом, и лиц, получающиххимиотерапию 1. Инфекция в этих популяциях часто является результатом еды загрязненных пищевых продуктов, и большинство инфекций связаны с крупномасштабными вспышкамипищевого происхождения 2,3. У людей и других млекопитающих, L. monocytogenes способен транслокации через эпителианую границу тонкой кишки, после чего транспортируется впечень 4,5. Модели животных предполагают, что попадает бактерий репликации в кишечном вилли и транзита в печень через портал вены или распространяется через мезентериотических лимфатических узлов в кровоток, что приводит к гематогенного распространения в печени иселезенки 6,7. В печени и селезенке бактерия способна опоясыть поглощение как в профессиональные фагоциты, так и в резидентные паренхимальные клетки, и быстро устанавливает инфекции в этих органах. По мере увеличения бактериальной нагрузки, многочисленные бактерии рассредоточены обратно в кровь, где они способны дальнейшей колонизации восприимчивых тканей, включая центральную нервную систему и плаценту (где присутствует). Колонизация этих участков исключает наиболее распространенные проявления листериоза у людей, включая менингит, энцефалит и аборт плода2.

Выбранные субпопуляции L. monocytogenes были недавно показано, что повышенная способность вторгаться и размножаться в сердечной ткани8. Проявления сердечного вмешательства разнообразны, и варьируются от эндокардита и перикардита, до фульминантного миокардита в комплекте снарушениями проводимости 9-13. Общее число случаев сердечного заболевания L. monocytogenes в год является низким, но может быть меньше, так как этот аспект инфекции, как правило, не хорошо признается. Колонизация сердца патогенными микроорганизмами часто требует предрасположенности хозяина, такой как уже существующие клапанные повреждения или искусственные клапаны сердца. Есть, однако, изоляты L. monocytogenes, которые были определены, которые отличаются своей способностью колонизировать сердца инфицированных животных при отсутствии каких-либо сердечных повреждений и / илианомалий 8.

В этом описаны методы in vitro и in vivo для оценки бактериальной колонизации сердечной ткани у инфицированных животных с использованием нашествия анализов в культуре тканей, а также инфекций живых животных. Эти методы оказались полезными не только для выявления штаммов с потенциалом колонизации сердечной ткани у инфицированных животных, но также должны быть полезны для выявления бактериальных генных продуктов, которые служат для повышения вторжения сердечной клетки и / или привести к изменениям в патологии сердца. Эти методы облегчают сравнение кардиотропизма между несколькими штаммами. Для описанных здесь методов L. monocytogenes 10403S используется в качестве хорошо изученного представителя недиотропного штамма, а клинический изолят 07PF0776 используется в качестве репрезентативного примера кардиотропного штамма. Эти два штамма были выбраны для обеспечения сравнения для бактериального вторжения сердечных клеток в пробирке и колонизации сердца инфицированных мышей in vivo. Изолят 07PF0776 является клиническим изолятом, восстановленным после промежуточного абсцесса, который вызвал смертельную аритмию у ВИЧ-инфицированногопациента 8. L. monocytogenes изолирует может варьироваться в их вирулентности потенциал, и, учитывая склонность к Listeria заразить людей с иммуносупрессией и беременных женщин, лица в этих популяциях должны проявлять осторожность при оценке различных клинических изолятов.

Protocol

1. Условия хранения и культуры для штаммов L. monocytogenes Подготовь твердые средства путем autoclaving агар вливания мозга-сердца (BHI) и заливки расплавленных средств в плиты Петри. Разрешить пластины высохнуть на ночь при комнатной температуре, а затем снова на ночь при температуре 37 гр?…

Representative Results

Выбранные изоляты L. monocytogenes демонстрируют усиленное вторжение сердечных клеток в клеточной культуре и в мышиных моделях инфекции. Рисунок 1 показывает пример того, как бактериальные колонии могут появиться после точечного покрытия суспензий на агар-медиа. Этот метод поз?…

Discussion

L. monocytogenes является широко распространенным и хорошо охарактеризованным патогеном человека, способным вызывать ряд различных проявлений заболевания15. Бактерия была ранее описана за его способность транслокировать через барьеры, такие как гемовно-мозговой барьер и плацента…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантами Службы общественного здравоохранения AI41816 и AI099339 (N.E.F.) и F31AI094886-01 (P.D.M.) от NIAID. Содержание является исключительно обязанностью авторов и не обязательно отражает официальную точки зрения источников финансирования.

Materials

Difco BHI Broth Base 237200 2KG of Brain Heart Infusion powder (without agar)
Difco Agar 214510 2KG of Granulated Agar
Difco BHI Agar 241810 2KG of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar
in vitrogen LB Broth Base 12975-084 2KG of Luria Broth Base Powder (without agar)
Fisher Glass Coverslips 12-545-80 12mm glass coverslips
Falcon 24-well Tissue Culture Plate 35-3047 24 Well, Plasma-treated Tissue Culture Plate
Falcon 14mL Polystyrene tube 352051 14mL Polystyrene tubes
Falcon 96-well U-bottom plate 35-3077 Non-tissue culture treated 96-well plate
Corning 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X) 25-052-CI Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture
Corning DMEM (High glucose, high pyruvate) 15-013-CU DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics
Corning Pen/Strep/Glut Solution 30-009-CI Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture
Corning Gentamicin 30-005-CR 50mg/mL Stock solution of Gentamicin for tissue culture
Cellgro (Corning) L-Glutamine 25005197 Stock L-glutamine solution without antibiotics
Denville 75cm^2 Flask T1225 75cm^2 tissue culture treated flask
Denville 1.5mL microcentrifuge tubes 2013004 1.5mL microcentrifuge tubes
ATCC H9c2 Cardiac Myoblasts CRL-1446 Rat cardiac myoblasts
Hyclone Fetal Bovine Serum SH30070.63 Fetal Bovine Serum

References

  1. Freitag, N. E. From hot dogs to host cells: how the bacterial pathogen Listeria monocytogenes regulates virulence gene expression. Future Microbiol. 1, 89-101 (2006).
  2. Drevets, D. A., Bronze, M. S. Listeria monocytogenes: epidemiology, human disease, and mechanisms of brain invasion. FEMS Immunol Med Microbiol. 53, 151-165 (2008).
  3. Farber, J. M., Peterkin, P. I. Listeria monocytogenes. a food-borne pathogen. Microbiol. Rev. 55, 476-511 (1991).
  4. Lecuit, M. Understanding how Listeria monocytogenes targets and crosses host barriers. Clin Microbiol Infect. 11, 430-436 (2005).
  5. Lecuit, M. Human listeriosis and animal models. Microbes Infect. 9, 1216-1225 (2007).
  6. Bou Ghanem, E. N., et al. InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice. PLoS Pathog. 8, e1003015 (2012).
  7. Melton-Witt, J. A., Rafelski, S. M., Portnoy, D. A., Bakardjiev, A. I. Oral infection with signature-tagged Listeria monocytogenes reveals organ-specific growth and dissemination routes in guinea pigs. Infect Immun. 80, 720-732 (2012).
  8. Alonzo, F., Bobo, L. D., Skiest, D. J., Freitag, N. E. Evidence for subpopulations of Listeria monocytogenes with enhanced invasion of cardiac cells. J Med Microbiol. , (2011).
  9. Adler, A., et al. Inflammatory pseudotumor of the heart caused by Listeria monocytogenes infection. J Infect. 58, 161-163 (2009).
  10. Antolin, J., Gutierrez, A., Segoviano, R., Lopez, R., Ciguenza, R. Endocarditis due to Listeria: description of two cases and review of the literature. Eur J Intern Med. 19, 295-296 (2008).
  11. Brouqui, P., Raoult, D. Endocarditis due to rare and fastidious bacteria. Clin Microbiol Rev. 14, 177-207 (2001).
  12. Brusch, J. L. Cardiac infections in the immunosuppressed patient. Infect Dis Clin North Am. 15, 613-638 (2001).
  13. McCue, M. J., Moore, E. E. Myocarditis with microabscess formation caused by Listeria monocytogenes associated with myocardial infarct. Hum Pathol. 10, 469-472 (1979).
  14. Menard, C., et al. Modulation of L-type calcium channel expression during retinoic acid-induced differentiation of H9C2 cardiac cells. J Biol Chem. 274, 29063-29070 (1999).
  15. Czuprynski, C. J. Listeria monocytogenes: silage, sandwiches and science. Anim Health Res Rev. 6, 211-217 (2005).
  16. Grundler, T., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
  17. Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes. PLoS Pathog. 7, e1002005 (2011).
  18. Kimes, B. W., Brandt, B. L. Properties of a clonal muscle cell line from rat heart. Experimental cell research. 98, 367-381 (1976).
  19. McMullen, P. D., et al. Genome sequence of Listeria monocytogenes 07PF0776, a cardiotropic serovar 4b strain. J Bacteriol. 194, 3552 (2012).

Play Video

Cite This Article
McMullen, P. D., Freitag, N. E. Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (99), e52497, doi:10.3791/52497 (2015).

View Video