Beurteilung der bakteriellen Invasion von Herzzellen in Kultur und Herzkolonisation bei infizierten Mäusen mit Listeria monocytogenes
Summary
Listeria monocytogenes verursacht fetale Infektionen bei Schwangeren und Meningitis in anfälligen Populationen. Subpopulationen von Bakterien können Herzgewebe besiedeln, was bei Patienten und Labortieren Zufluss zu Myokarditis führt. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das beschreibt, wie L. monocytogenes Herzzellinvasion in vitro und Herzkolonisation bei infizierten Tieren zu bewerten.
Abstract
Listeria monocytogenes ist ein grampositiver fakultativer intrazellulärer Erreger, der in der Lage ist, schwere invasive Infektionen bei immungeschwächten Patienten, älteren Menschen und Schwangeren zu verursachen. Die häufigsten Manifestationen der Listeriose beim Menschen sind Meningitis, Enzephalitis und fetale Abtreibung. Eine signifikante, aber viel weniger dokumentierte Fortsetzung der invasiven L. monocytogenes Infektion betrifft das Herz. Die Sterblichkeitsrate durch Herzerkrankungen kann trotz Behandlung bis zu 35% betragen, allerdings ist sehr wenig über die Besiedlung von Herzgewebe und deren folgenden Pathologien bekannt. Darüber hinaus hat sich in jüngster Zeit gezeigt, dass Subpopulationen von L. monocytogenes eine verbesserte Fähigkeit haben, in Herzgewebe einzudringen und zu wachsen. Dieses Protokoll beschreibt detailliert In-vitro- und In-vivo-Methoden, die zur Beurteilung des Kardiographenvon L. monocytogenes Isolate verwendet werden können. Methoden werden zur Infektion von H9c2-Ratten-Herzmyoblasten in der Gewebekultur sowie zur Bestimmung der bakteriellen Besiedlung der Herzen infizierter Mäuse vorgestellt. Diese Methoden sind nicht nur nützlich, um Stämme mit dem Potenzial zu identifizieren, Herzgewebe bei infizierten Tieren zu besiedeln, sondern können auch die Identifizierung von bakteriellen Genprodukten erleichtern, die dazu dienen, die Invasion von Herzzellen zu verbessern und/oder Veränderungen in der Herzpathologie voranzutreiben. Diese Methoden sehen auch den direkten Vergleich des Kardiontropismus zwischen mehreren L. monocytogenes Stämmen vor.
Introduction
Listeria monocytogenes ist ein grampositiver intrazellulärer Erreger, der schwere Krankheiten in anfälligen Populationen verursachen kann, einschließlich älterer Menschen, Schwangerer, HIV/AIDS-Patienten und Patienten, die eine Chemotherapie erhalten1. Infektionen in diesen Populationen sind häufig das Ergebnis der Einnahme kontaminierter Lebensmittel, und die meisten Infektionen sind mit großangelegten lebensmittelbedingten Ausbrüchen verbunden2,3. Bei Menschen und anderen Säugetieren ist L. monocytogenes in der Lage, sich über die Epithelgrenze des Dünndarms zu transortieren und anschließend in die Leber transportiert zu werden4,5. Tiermodelle deuten darauf hin, dass aufgenommene Bakterien sich innerhalb der Darmzotten vermehren und durch die Portalvene in die Leber gelangen oder sich über die mesenterischen Lymphknoten in den Blutkreislauf ausbreiten, was zu einer hämatogenen Verbreitung in der Leber und Milz6,7führt. In der Leber und Milz ist das Bakterium in der Lage, sowohl in professionelle Phagozyten als auch in ansässigen parenchymalen Zellen zu vermitteln und stellt schnell Infektionen in diesen Organen her. Mit zunehmender bakterieller Belastung werden zahlreiche Bakterien wieder ins Blut verteilt, wo sie in der Lage sind, empfängliche Gewebe, einschließlich des zentralen Nervensystems und der Plazenta (sofern vorhanden), weiter zu besiedeln. Kolonisierung dieser Standorte schließt die häufigsten Manifestationen der Listeriose beim Menschen, einschließlich Meningitis, Enzephalitis, und fetale Abtreibung2.
Ausgewählte Subpopulationen von L. monocytogenes haben vor kurzem gezeigt, dass eine verbesserte Fähigkeit, in Herzgewebe eindringen und replizieren8. Manifestationen der Herzbeteiligung sind vielfältig und reichen von Endokarditis und Perikarditis bis hin zu fulminanten Myokarditis mit Leitstörungen9-13. Die Gesamtzahl der L. monocytogenes Herzfälle pro Jahr ist gering, kann aber unterschätzt werden, da diese Facette der Infektion im Allgemeinen nicht gut erkannt wird. Die Besiedlung des Herzens durch Krankheitserreger erfordert oft Wirtsveranlagungen wie bereits bestehende Valvularschäden oder künstliche Herzklappen. Es gibt jedoch Isolate von L. monocytogenes, die identifiziert wurden, die für ihre Fähigkeit, die Herzen der infizierten Tiere in Ermangelung von Herzschäden und/oder Anomalien8zu besiedeln bemerkenswert sind.
Hierin werden in vitro und in vivo Methoden zur Beurteilung der bakteriellen Besiedlung von Herzgewebe in infizierten Tieren mit Invasions-Assays in der Gewebekultur sowie lebenden Tierinfektionen beschrieben. Diese Methoden haben sich nicht nur bei der Identifizierung von Stämmen mit dem Potenzial zur Besiedlung von Herzgewebe bei infizierten Tieren als nützlich erwiesen, sondern sollten auch für die Identifizierung von bakteriellen Genprodukten nützlich sein, die dazu dienen, die Invasion von Herzzellen zu verbessern und/oder zu Veränderungen in der Herzpathologie führen. Diese Methoden erleichtern den Vergleich des Kardiographen zwischen mehreren Stämmen. Für die hier beschriebenen Methoden wird L. monocytogenes 10403S als gut untersuchter Vertreter eines nichtkardiotropen Stammes und das klinische Isolat 07PF0776 als repräsentatives Beispiel für einen kardiotropen Stamm verwendet. Diese beiden Stämme wurden ausgewählt, um einen Vergleich für die bakterielle Invasion von Herzzellen in vitro und die Besiedlung von Herzen infizierter Mäuse in vivozu liefern. Das Isolat 07PF0776 ist ein klinisches Isolat, das aus einem interventrikulären Abszess gewonnen wurde, der bei einem HIV+-Patienten eine tödliche Arrhythmie verursachte8. L. Monocytogenes-Isolate können in ihrem Virulenzpotenzial variieren, und angesichts der Neigung für Listerien, Personen mit Immunsuppression zu infizieren und Schwangere, sollten Personen innerhalb dieser Populationen bei der Beurteilung verschiedener klinischer Isolate Vorsicht walten lassen.
Protocol
Representative Results
Discussion
L. monocytogenes ist ein weit verbreiteter und gut charakterisierter menschlicher Erreger, der in der Lage ist, eine Reihe verschiedener Krankheitserscheinungen zu verursachen15. Das Bakterium wurde zuvor für seine Fähigkeit beschrieben, über Barrieren, wie die Blut-Hirn-Barriere und Plazenta-fetale Barrieren zu translozieren, um das zentrale Nervensystem zu erreichen und zu besiedeln bzw. Fötus zu entwickeln. Die In-vivo-Fähigkeit des Organismus, diese Gewebe zu besiedeln, wird oft durc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse des öffentlichen Gesundheitsdienstes AI41816 und AI099339 (N.E.F.) sowie durch F31AI094886-01 (P.D.M.) von NIAID unterstützt. Die Inhalte liegen allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht unbedingt die offizielle Meinung der Finanzierungsquellen dar.
Materials
| Difco | BHI Broth Base | 237200 | 2KG of Brain Heart Infusion powder (without agar) |
| Difco | Agar | 214510 | 2KG of Granulated Agar |
| Difco | BHI Agar | 241810 | 2KG of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar |
| in vitrogen | LB Broth Base | 12975-084 | 2KG of Luria Broth Base Powder (without agar) |
| Fisher | Glass Coverslips | 12-545-80 | 12mm glass coverslips |
| Falcon | 24-well Tissue Culture Plate | 35-3047 | 24 Well, Plasma-treated Tissue Culture Plate |
| Falcon | 14mL Polystyrene tube | 352051 | 14mL Polystyrene tubes |
| Falcon | 96-well U-bottom plate | 35-3077 | Non-tissue culture treated 96-well plate |
| Corning | 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X) | 25-052-CI | Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture |
| Corning | DMEM (High glucose, high pyruvate) | 15-013-CU | DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics |
| Corning | Pen/Strep/Glut Solution | 30-009-CI | Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture |
| Corning | Gentamicin | 30-005-CR | 50mg/mL Stock solution of Gentamicin for tissue culture |
| Cellgro (Corning) | L-Glutamine | 25005197 | Stock L-glutamine solution without antibiotics |
| Denville | 75cm^2 Flask | T1225 | 75cm^2 tissue culture treated flask |
| Denville | 1.5mL microcentrifuge tubes | 2013004 | 1.5mL microcentrifuge tubes |
| ATCC | H9c2 Cardiac Myoblasts | CRL-1446 | Rat cardiac myoblasts |
| Hyclone | Fetal Bovine Serum | SH30070.63 | Fetal Bovine Serum |
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