Рыбок данио кератоцитов Экспланты по изучению коллективной миграции клеток и реэпителизации кожного заживления ран

Исследования клеточной подвижности традиционно сосредоточено на индивидуальном мигрирующих клеток. Кератоциты культивированный из рыбы и амфибии эксплантов оказались мощным модельной системой для изучения механизмов клеточной подвижности с помощью как экспериментальных, так и математическое моделирование подходов ^1-6. Экспериментальная работа по отдельности, мигрирующих клеток автоматизированного быстрым, плавным движением скользящей клеток, сохраняя одинаковую форму, скорость и направление. Тем не менее, в живом организме, клетки часто двигаться вместе при поддержании межклеточных соединений, в частности, в процессе эмбриогенеза, заживления ран, и метастазирования. Таким образом, коллектив миграция клеток является растущей и все более важной областью исследований в рамках области миграции клеток. Коллектив миграция этих клеток недавно были описаны ⁷ и она имеет много уникальных особенностей, которые делают его мощная система для изучения коллективного миграцию клеток в модели заживления раны.

ove_content "> Когда весы сорвал с наркозом взрослых данио, некоторые эпителиальной ткани остается привязанным к нижней части шкалы. Когда среда для культивирования клеток добавляется, эти эпителиальные клетки, или кератиноциты, быстро мигрируют в качестве коллективного устройства от масштаба. Эксплант можно рассматривать как эпителиального заживления ран модели, в которой клетки мигрируют от эксплантов, как они будут по предварительной матрицы раневое ложе, чтобы восстановить интактный эпителий. Последние данные показывают, что этот экс виво культуры имитирует многие особенности в естественных условиях заживление ран у взрослых рыбок данио. Рана скоростью сближения ⁸ перевести на скорость миграции аналогичной той, что наблюдается в Экс Vivo системы ^7. Кроме того, в раны в естественных условиях модели заживления, лечение варфарином позволяет предположить, что гемостаз не влияет на скорость исцеления, в то время как обработка гидрокортизоном для уменьшения иммунный ответ не задерживает реэпителизацию ⁸ </SUP>. Как данио не кровоточат, когда шкала удаляется из животного, гемостаз не является основным игроком. Хотя мы нашли иммунные клетки в эксплантов, мы не изучали влияние они могут оказать на коллективной миграции клеток.

Протокол, представленные здесь описывает, как установить данио культуры кератоцитов эксплантов, обеспечивающие согласованность и воспроизводимость для использования во многих биологических анализов. Эти эксплантов культуры являются особенно очевидной в пробирке модель для коллективного миграции клеток по нескольким причинам. Во-первых, данио кератоциты являются первичные клетки, используемые в течение нескольких часов создания эксплантов культур. Таким образом, эти клетки не претерпели морфологические и генетические изменения выражение, связанное с прохождением первичных клеток ^9-13. Во-вторых, эта система представляет собой модель для изучения реэпителизации в ответ на ранение ^14, а в рамках ответа на ранения, эпителиальной к мезенхимальных TRansition (EMT) процесс инициируется о чем свидетельствуют изменения в экспрессии генов и цитоскелета перестроек ^14,15. Таким образом, фоновые изменения в экспрессии генов и подвижности, которые происходят в необработанных клеток были охарактеризованы и обеспечивают контекст для интерпретации изменения с лечения. Кроме того, рыба кератоцитов и кератиноцитов человека функционально эквивалентны; оба первичные эпителиальные клетки соответствующих видов и играют ключевую роль в заживлении ран эпителия. В-третьих, взрослых данио приобретают все большее признание в качестве модельной системы для различных заболеваний человека ^16-18 в том числе меланомы и других раковых заболеваний ^19-21, кожные заживления ран ^8,14 и регенерации тканей ^22-24.

Технические преимущества этой модельной системы одинаково убедительными. Все большее число мутантных и трансгенных линий доступны из некоммерческих, централизованных. В частности, мутации проекта данио рерио (ZMP) В Wellcome Trust Sanger Institute направлена ​​на создание нокаутом аллель в каждом кодирующей белок гена в данио генома. В настоящее время они мутировали 11892 генов, примерно 45% генома, с 24088 аллелей отличающийся. Кроме того, ZMP принимает предложения и будет генерировать нокауты бесплатно. Последние методы генной нокдаун в личиночной и взрослых данио ^25-28 обеспечивают гибкость для изучения функции с развитием важных генов, для которых трансгенные подходы проблематично или нецелесообразно.

Из-за их чрезвычайно быстрыми темпами моторики ~ 145 мкм / ч вскоре после создания культур ^29, анализы могут быть быстро завершена (как правило, в 24 ч или менее). Как эксперименты могут быть быстро завершена, и культуры хорошо растут при комнатной температуре, несколько технических препятствий, связанных с миграцией клеток млекопитающих, включающие анализы видеомикроскопия избежать. Кроме того, в эпоху ужесточения исследовательские бюджеты, zebrafМОГ легко и недорого поддерживать.

Структура и поведение эксплантов является сложным. Как рыба не кровоточат, когда шкала удаляется, то маловероятно, что намного больше, чем поверхностные слои эпидермиса удаляются с масштабом. Кератиноциты, по всей видимости, является преобладающим типом клеток в эксплантов, когда весы, первоначально удалены из рыбы, подавляющее большинство клеток, по всей видимости пятно с анти-Е-кадгерина антителом ^14. Кроме того, нет никаких доказательств того, фибробластов в первичной культуры можно судить по отсутствию окраски виментина с помощью иммунофлуоресценции ^14. Тем не менее, с удалением повторном масштаба, как представляется, быть многочисленные нейтрофилы в эксплантата (смотрите видео 1). Мы определили, как эти клетки нейтрофилов на основе морфологических наблюдений от их размера, быстро подвижности, а также их миграции из клетки листа при воздействии на LPS (данные не показаны). Кроме того, эти клетки окрашиваются ярко остроумиеч антитело к нейтрофилов цитозольного фактора, а также с различными вторичными антителами IgG, что указывает, что они имеют обильные FcRs на своей поверхности (данные не показаны). Несколько слоев клеток присутствуют в эксплантов. Конфокальной микроскопии обнаруживается присутствие одного слоя вблизи переднего края до более чем двух слоев кератоцитов возле шкалы с нейтрофилов видимых сверху, снизу, и между клеткой кератоцитов листов.

В начале временных точках, клетки на краю многослойной эксплантов поляризации, инициирующего коллективного миграции кератоцитов из эксплантов на начальных скоростей ~ 145 мкм / ч. Площадь, покрытая эксплантата быстро возрастает, что приводит к ячейке распространения, напряжение в пределах листа, а пониженная скорость продвижения передней кромки. Быстрые взаимные между лидером и последователем клеток наблюдаются на переднем крае в процессе формирования и закрытия спонтанно образующихся отверстий в листе ^7. КакEMT процесс, начатый с эксплантата продолжает лист фрагменты и кератиноциты теряют специализированные, быстрый моторику. Экспрессия генов и морфологические изменения, согласующиеся с EMT, заживление ран и воспалительные реакции происходят в течение 7 дней культуры с экспланты рассматривается жизнеспособность в течение примерно 10 дней ^14.