ゼブラフィッシュ角膜実質外植片は皮膚創傷治癒における集団細胞の移動および再上皮化を研究するために

細胞運動性の研究は、伝統的に、個別に移動する細胞に集中している。魚や両生類外植片からの培養された角膜実質^1-6に^近づく実験的および数学的モデリングの両方を使用して、細胞運動のメカニズムを研究するための強力なモデル系であることが判明している。均一な形状、速度、および方向を維持しながら、個別に移動する細胞に対する実験研究は、細胞の急速な、滑らかな滑走運動によって補助される。特に、胚形成、創傷治癒、および転移の間に、細胞間結合を維持しながら、しかし、 インビボにおいて 、細胞は、しばしば集合的に移動する。したがって、集合的な細胞移動、細胞遊走のフィールド内の研究の成長とますます顕著領域である。これらの細胞の集合的な移行は、最近^7に記載されており、それは創傷治癒モデルにおいて、集団の細胞遊走を研究するための強力なシステムにする多くのユニークな特徴を有している。

ove_content ">スケールが麻酔され、成体ゼブラフィッシュから引き抜かれると、いくつかの上皮組織は、スケールの下側に取り付けられたままである。細胞培養培地は、これらの上皮細胞、または角膜を添加する場合、スケールからの集合的な単位として急速に移行する。ザ·移植片培養は、細胞が無傷の上皮を再確立するために離れて外植片から、彼らは、創傷床の暫定マトリックス全体に同じように移行するモデル治癒上皮創傷、と見ることができる。最近のデータは、このex vivoでの文化を模倣し、多くの機能を示唆しているin vivoで成体ゼブラフィッシュにおける創傷治癒。創傷閉鎖率は⁸ エキソビボ系⁷で観察されるものと同様の移動速度に変換する。また、 インビボでの創傷治癒モデル、ワルファリンによる治療は、止血率に影響を及ぼさないことを示唆している治癒、免疫応答を低下させるヒドロコルチゾンでの処置は再上皮^8を遅らせていない間</SUP>。スケールは動物から除去されたとき、ゼブラフィッシュが出血しないように、止血は主要なプレーヤーではない。私たちは外植で免疫細胞を発見したが、我々は彼らが集団的細胞遊走に与えるかもしれない影響を研究していません。

ここで紹介するプロトコルは、多くの生物学的アッセイで使用するための一貫性と再現性を確保するゼブラフィッシュ角膜実質植片培養を確立する方法について説明します。これらの外植片培養は、いくつかの理由のために集団的細胞移動のためのin vitroモデルでは特に魅力的である。まず、ゼブラフィッシュ角膜実質は外植文化を確立する時間以内に使用される主要な細胞である。したがって、これらの細胞は、初代細胞^9-13の通路に関連付けられた形態学的および遺伝子発現の変化を受けていない。第二に、このシステムは、創傷への応答、間葉trの上皮の一部として^、14が負傷に応答して、再上皮化の研究のためのモデルを表すと遺伝子発現の変化および細胞骨格再配列^14,15によって証明されるようにansition（EMT）プロセスが開始される。したがって、未処理の細胞において生じる遺伝子発現と運動性の背景の変化が特徴づけおよび処置変化を解釈するためのコンテキストを提供してきた。また、魚の角膜実質とヒトケラチノサイトは、機能的に同等である。両方は、それぞれの種の主要な上皮細胞である上皮創傷治癒において重要な役割を果たしている。第三に、大人のゼブラフィッシュは、黒色腫および他の癌^19-21、8,14および組織再生^22-24治癒皮膚の創傷を含むヒト疾患^16-18の様々なモデル系として認識を得ている。

このモデルシステムの技術的利点は、同じように魅力的である。突然変異体およびトランスジェニック系統が増え、非営利、集中型の施設から利用できます。具体的には、ゼブラフィッシュ変異プロジェクト（ZMP）ウェルカム·トラスト·サンガー研究所では、ゼブラフィッシュゲノム中のすべてのタンパク質をコードする遺伝子中にノックアウト対立遺伝子を作成することを目指しています。現在、彼らは特徴付け24088アレルで、11892遺伝子、ゲノムの約45％に変異している。また、ZMPは提案を受け入れ、無償でノックアウトを生成します。幼虫と大人のゼブラフィッシュ^25-28における遺伝子ノックダウンの最近の方法は、トランスジェニックアプローチが問題か、非現実的であるために発生上重要な遺伝子の機能を研究するための柔軟性を提供する。

〜145ミクロン/ hrの運動性の彼らの非常に急速な速度に起因する間もなく文化²⁹の設立後、アッセイは（通常は24時間以内に）迅速に完了することができます。実験は迅速に完了することができ、培養物を室温で十分に成長するにつれ、ビデオ顕微鏡を含む哺乳動物細胞遊走アッセイに関連する技術的なハードルのいくつかは回避される。また、研究予算を締めるの時代に、zebrafISHは、容易かつ安価に維持されている。

外植片の構造と動作は複雑である。スケールが除去されると、魚が出血しないように、表面的な表皮層よりもはるかに規模で除去するとは考えにくい。角膜実質細胞の大部分は抗E-カドヘリン抗体¹⁴を染色するために表示されるスケールは、最初に魚から除去されるときに、外植片における優勢な細胞型であるように見える。さらに、免疫蛍光¹⁴によってビメンチン染色の欠如によって判断されるように、最初の培養における線維芽細胞の証拠はない。しかし、繰り返しスケール除去と、（ ビデオ1を参照） を植片における多数の好中球があるように思われる。 LPSにさらされたとき、我々は、それらのサイズ、急速に運動性、および細胞シートのうち、それらの移動の形態学的観察に基づいて、好中球のような、これらの細胞を同定した（データは示さず）。さらに、これらの細胞は明るくウィットを染色好中球サイトゾル因子ならびにとともに、それらがその表面上に豊富なFcRを有することを示す二次IgG抗体の様々な抗体（データは示していない）時間。複数の細胞層が外植片内に存在する。共焦点顕微鏡は、上、下、及び細胞角膜実質細胞シート間の可視好中球スケール付近の角膜実質層以上の前縁付近単層の存在を明らかにする。

初期の時点では、〜145ミクロン/ hrの初期レートでの外植片から角膜実質の集合的な移行を開始する多層外植分極しの端に、上の細胞。外植片によって覆われる領域が急速に増加し、シート内で、張力を拡散セルにつながる、前縁の進行速度の低下。リーダーとフォロワー細胞との間の迅速な相互変換は、シート⁷内で自然発生的に形成されたホールの形成及び閉鎖時の前縁で観察される。として外植片を用いて開始EMTプロセスは、シート断片を継続し、角膜実質細胞は、特殊化した、迅速な運動性を失う。遺伝子発現とEMTと一致して形態変化、創傷治癒、および炎症反応は外植は約10日間¹⁴のための実行可能な検討されて培養7日以内に発生する。