Zebrafish Keratocyte espianti per studiare la migrazione delle cellule collettiva e riepitelizzazione in guarigione delle ferite cutanee

Studi di motilità cellulare si sono tradizionalmente concentrati sulle cellule migrano individualmente. Cheratociti coltivate dai pesci e anfibi espianti hanno dimostrato di essere un sistema potente modello per studiare i meccanismi di motilità cellulare utilizzando la modellazione sia sperimentale e matematica approcci ^1-6. Il lavoro sperimentale sulle cellule migrano singolarmente è aiutata dal rapido movimento scorrevolezza delle cellule, mantenendo uniforme forma, velocità e direzione. Tuttavia, in vivo, le cellule si muovono spesso insieme pur mantenendo giunzioni cellula-cellula, in particolare durante l'embriogenesi, la guarigione delle ferite, e le metastasi. Così, la migrazione cellulare collettiva è un settore in crescita e sempre più importante della ricerca nel campo della migrazione delle cellule. La migrazione collettiva di queste cellule è stata recentemente descritta ⁷ ed ha molte caratteristiche uniche che lo rendono un potente sistema per studiare la migrazione delle cellule collettiva in un modello di guarigione delle ferite.

ove_content "> Quando le scale vengono pizzicate da un zebrafish adulto anestetizzato, alcuni tessuti epiteliali rimane attaccato alla parte inferiore della scala. Quando si aggiunge mezzo di coltura cellulare, queste cellule epiteliali, o cheratociti, migrano rapidamente come unità collettiva dalla scala. Il Espianto può essere visto come un modello di guarigione delle ferite epiteliale, in cui le cellule migrano dalla espianto come farebbero nella matrice provvisoria del letto della ferita per ristabilire un epitelio intatto. Dati recenti suggeriscono che questa coltura ex vivo imita molte caratteristiche di in vivo la guarigione delle ferite in zebrafish adulto. tassi chiusura della ferita ⁸ si traducono in una velocità di migrazione simile a quello osservato nella ex vivo sistema ^7. Inoltre, in una ferita in vivo guarigione del modello, il trattamento con warfarin suggerisce che l'emostasi non ha alcun effetto sul tasso di di guarigione, mentre il trattamento con idrocortisone per diminuire la risposta immunitaria non ritardare riepitelizzazione ⁸ </sup>. Come il pesce zebra non sanguina quando la bilancia è rimosso dall'animale, emostasi non è un giocatore importante. Anche se abbiamo trovato cellule immunitarie in espianti, non abbiamo studiato gli effetti che potrebbero avere sulla migrazione cellulare collettiva.

Il protocollo presentato qui descritto come stabilire le culture zebrafish keratocyte espianto a garantire la coerenza e riproducibilità per l'uso in molti saggi biologici. Queste culture espianto sono particolarmente convincenti modello in vitro per la migrazione delle cellule collettivo per diversi motivi. In primo luogo, cheratociti zebrafish sono pile utilizzate entro ore di stabilire culture espianto. Pertanto, queste cellule non hanno subito i cambiamenti morfologici e espressione genica associati con passaggio di cellule primarie ^9-13. In secondo luogo, questo sistema rappresenta un modello per lo studio di riepitelizzazione in risposta al ferimento ¹⁴ e, come parte della risposta al ferimento, un epiteliale al mesenchimale transition processo (EMT) è iniziata come evidenziato da cambiamenti nell'espressione genica e riarrangiamenti del citoscheletro ^14,15. Così, lo sfondo cambiamenti nell'espressione genica e motilità che si verificano in cellule non trattate sono stati caratterizzati e fornire un contesto per interpretare modifiche con trattamento. Inoltre, il pesce e la keratocyte cheratinociti umani sono funzionalmente equivalenti; entrambi sono le cellule epiteliali primarie dei rispettivi specie e svolgono un ruolo chiave nella epiteliale guarigione della ferita. In terzo luogo, zebrafish adulto stanno guadagnando il riconoscimento come sistema modello per una varietà di malattie umane ^16-18 tra cui il melanoma e altri tumori ^19-21, ferita cutanea guarigione ^8,14 e Rigenerazione Tissutale ^22-24.

I vantaggi tecnici di questo modello di sistema sono altrettanto convincenti. Un numero crescente di linee mutanti e transgeniche sono disponibili dal non-profit, servizi centralizzati. In particolare, la mutazione progetto Zebrafish (ZMP) Presso il Wellcome Trust Sanger Institute mira a creare un allele knockout in ogni proteina gene nel genoma zebrafish. Attualmente, hanno mutato 11.892 geni, circa il 45% del genoma, con 24.088 alleli caratterizzati. Inoltre, ZMP accetta proposte e genererà knock-out gratuitamente. Metodi Recenti gene atterramento in larvale e adulto zebrafish ^25-28 forniscono la flessibilità per studiare la funzione dei geni evolutivamente importanti per i quali approcci transgenici sono problematici o impraticabili.

Grazie alla loro estremamente rapidi tassi di motilità di ~ 145 micron / h poco dopo creazione di culture ^29, analisi possono essere completate rapidamente (di solito in 24 ore o meno). Come esperimenti possono essere concluse rapidamente e culture crescono bene a temperatura ambiente, molti degli ostacoli tecnici associati sono evitati mammiferi test di migrazione delle cellule che coinvolgono microscopio video. Inoltre, in età di serraggio bilanci di ricerca, zebrafish è facile ed economico mantenuto.

La struttura e il comportamento del trapianto è complessa. Come il pesce non sanguinano quando la scala viene rimosso, è improbabile che molto più strati epidermici superficiali vengono rimossi con la scala. Cheratociti sembrano essere il tipo cellulare predominante nel espianto quando squame sono inizialmente rimossi dal pesce come la stragrande maggioranza delle cellule sembra macchiare con un anticorpo anti-E-caderina ^14. Inoltre, non vi è alcuna prova di fibroblasti in coltura iniziale come giudicato dalla mancanza di vimentina colorazione mediante immunofluorescenza ^14. Tuttavia, con la rimozione ripetuta scala, sembra che vi siano numerosi neutrofili nel espianto (vedi Video 1). Abbiamo identificato queste cellule come neutrofili basati su osservazioni morfologiche delle loro dimensioni, rapidamente motilità e la loro migrazione fuori dello strato di cellule quando esposto a LPS (dati non mostrati). Inoltre, queste cellule si colorano vivacemente with un anticorpo di neutrofili fattore citosolico e con una varietà di anticorpi secondari IgG, che indica che essi hanno FCRS abbondanti sulla loro superficie (dati non mostrati). Strati di cellule multiple sono presenti all'interno del espianto. Microscopia confocale rivela la presenza di un solo strato vicino al bordo superiore per più di due strati di cheratinociti vicino scala con neutrofili visibili sopra, sotto, e tra i fogli keratocyte cellulare.

A momenti iniziali, le cellule sul bordo del multi-layer espianto polarizzare, avviando la migrazione collettiva del cheratociti dalla espianto a tassi iniziali di ~ 145 micron / hr. L'area coperta dal espianto aumenta rapidamente, portando a cellule diffusione, la tensione all'interno del foglio, e un tasso ridotto di avanzamento del bordo d'attacco. Interconversioni rapidi tra le cellule capo e follower si osservano sul bordo di entrata durante la formazione e la chiusura di fori spontaneamente costituiti all'interno del foglio ^7. ComeProcesso di EMT avviato con l'espianto continua, i frammenti fogli e le cheratociti perdono la loro specializzazione, rapida motilità. Espressione genica e cambiamenti morfologici coerenti con EMT, la guarigione delle ferite, e le risposte infiammatorie si verificano entro 7 giorni di coltura con espianti presi in considerazione valida per circa 10 giorni ^14.