Zebrafisch Keratozyten Explantate auf Collective Zellmigration und Reepithelialisierung in kutane Wundheilung Studieren

Studium der Zellbewegung traditionell auf individuell wandernden Zellen konzentriert. Keratozyten von Fischen und Amphibien Explantate kultiviert haben sich als ein leistungsfähiges Modellsystem, um die Mechanismen der Zellbeweglichkeit Studie mit experimentellen und mathematischen Modellierung nähert ^1-6 sein. Experimentelle Arbeiten auf individuell wandernden Zellen wird durch die schnelle, leichtgängige Bewegung der Zellen unterstützt, und gleichzeitig eine gleichmäßige Form, Geschwindigkeit und Richtung. In vivo werden Zellen kollektiv bewegen häufig während Zell-Zell-Junctions, insbesondere während der Embryogenese, Wundheilung und Metastase. So ist kollektive Zellmigration eine wachsende und immer wichtigere Forschungsgebiet im Bereich der Zellmigration. Die kollektive Migration dieser Zellen wurde vor kurzem beschrieben ⁷ und es hat viele einzigartige Eigenschaften, die es ein leistungsfähiges System zur kollektiven Zellmigration in einer Wundheilung Modell untersuchen zu machen.

ove_content "> Beim Schuppen werden aus einem betäubten erwachsenen Zebrafisch gezupft bleibt etwas Epithelgewebe an der Unterseite des Umfangs angebracht ist. Wenn die Zellkulturmedium zugegeben wird, diese Epithelzellen oder Keratozyten, schnell wandern als Sammeleinheit von der Skala. Das Explantatkultur kann als epitheliale Wundheilung Modell, in dem die Zellen wandern vom Explantat wie sie es in der vorläufigen Matrix eines Wundbett um ein intaktes Epithel wiederherzustellen angesehen werden. Neuere Daten legen nahe, dass dieser ex vivo-Kultur imitiert viele Merkmale in vivo Wundheilung bei erwachsenen Zebrafisch. Wundverschlussraten ⁸ zu einer Wanderungsgeschwindigkeit ähnlich zu der in den ex-vivo-System ⁷ beobachtet übersetzen. Zusätzlich wird in einem in vivo-Wundheilungsmodell Behandlung mit Warfarin legt nahe, dass die Hämostase hat keine Auswirkung auf die Geschwindigkeit der Heilung, ist während der Behandlung mit Hydrocortison zur Immunantwort verringern nicht Reepithelialisierung ⁸ verzögern </sup>. Da der Zebrafisch blutet nicht, wenn die Waage aus dem Tier entfernt wird, ist die Blutstillung nicht ein wichtiger Akteur. Obwohl wir Immunzellen im Explantate finden, haben wir nicht die Auswirkungen sie auf kollektive Zellmigration haben könnte untersucht.

Die hier vorgestellte Protokoll beschreibt, wie Zebrafisch Keratozyten Explantatkulturen, die Konsistenz und Reproduzierbarkeit für den Einsatz in vielen biologischen Tests gewährleistet werden kann. Diese Explantatkulturen sind aus mehreren Gründen besonders überzeugende in-vitro-Modell für gemeinsame Zellmigration. Erstens sind die Zebrafisch-Keratozyten Primärzellen innerhalb weniger Stunden nach Gründung Explantatkulturen verwendet. Deshalb wurden diese Zellen nicht die morphologischen Veränderungen der Genexpression und mit dem Durchgang von primären Zellen assoziiert ^9-13 unterzogen. Zweitens, stellt dieses System ein Modell für die Untersuchung der Reepithelialisierung in Antwort auf Verwundung ¹⁴ und, als Teil der Antwort auf Verwundung eines epithelialen mesenchymale transition Prozess (EMT) initiiert wird, wie Veränderungen in der Genexpression und der Umordnung des Cytoskeletts ^14,15 belegt. Somit ändert sich der Hintergrund in der Genexpression und der Beweglichkeit, die in unbehandelten Zellen auftreten wurden charakterisiert und einen Rahmen, um Änderungen bei der Behandlung zu interpretieren. Darüber hinaus die Fische Keratozyten und die menschliche Keratinozyten sind funktionell gleichwertig; beide sind die primären Epithelzellen der jeweiligen Arten und spielen eine Schlüsselrolle in epithelialen Wundheilung. Drittens erwachsenen Zebrafisch werden zunehmend Anerkennung als ein Modellsystem für eine Vielzahl von Krankheiten beim Menschen ^16-18 einschließlich Melanomen und anderen Krebs ^19-21, kutane Wundheilung ^8,14 und Geweberegeneration ^22-24.

Technische Vorteile dieses Modellsystems sind gleichermaßen überzeugend. Eine wachsende Zahl von Mutanten und transgenen Linien sind von Non-Profit, zentrale Einrichtungen. Insbesondere wird das Zebrafisch-Mutation Project (ZMP) Am Wellcome Trust Sanger Institute zielt darauf ab, einen KO-Allel in jedem Protein kodierenden Gens im Zebrafisch-Genom zu schaffen. Derzeit haben sie 11.892 Gene, etwa 45% des Genoms mutiert, mit 24.088-Allele aufweist. Darüber hinaus übernimmt ZMP Vorschläge und Knock-outs kostenlos zu generieren. Neue Methoden der Gen-Knockdown in Larven und erwachsenen Zebrafisch ^25-28 bieten Flexibilität, um die Funktion von entwicklungspolitisch wichtige Gene für die transgene Ansätze problematisch oder unmöglich zu studieren.

Durch ihre extrem schnelle Raten von Motilität von ~ 145 um / h kurz nach Gründung der Kulturen ²⁹ können Assays schnell (in der Regel in 24 Stunden oder weniger) durchgeführt werden. Wie Versuche kann schnell abgeschlossen werden und Kulturen wachsen gut bei RT mehrere der technischen Hürden mit Säugerzellmigration Assays, die Videomikroskopie vermieden verbunden. Außerdem im Zeitalter der Anzugsforschungsbudgets, zebrafish sind einfach und kostengünstig gepflegt.

Die Struktur und das Verhalten der Explantation ist komplex. Da die Fische nicht ausbluten, wenn die Waage entfernt wird, ist es unwahrscheinlich, dass viel mehr als die oberflächlichen Schichten der Epidermis mit der Waage entfernt. Keratozyten scheinen die vorherrschende Zelltyp in dem Explantat, wenn Skalen werden zunächst aus dem Fisch entfernt, da die große Mehrheit der Zellen scheinen mit einem Anti-E-Cadherin-Antikörper ¹⁴ zu färben. Darüber hinaus gibt es keine Hinweise auf Fibroblasten in der Vorkultur wie durch die Abwesenheit von Vimentin Färbung beurteilt durch Immunofluoreszenz ^14. Aber mit wiederholter Steinentfernung scheint es zahlreiche Neutrophile in der Explantation (siehe Video 1). Wir haben diese Zellen wie Neutrophile, basierend auf morphologischen Beobachtungen ihrer Größe schnell Motilität und ihre Migration aus der Zelle ausgewiesenen, wenn sie LPS ausgesetzt (Ergebnisse nicht gezeigt). Zusätzlich werden diese Zellen zu färben hell Witzh ein Antikörper gegen Neutrophilen cytosolischen Faktor sowie mit einer Vielzahl von sekundären IgG-Antikörper, was darauf hinweist, dass sie reichlich FcRs auf ihrer Oberfläche haben (Daten nicht gezeigt). Mehrere Zellschichten sind in der Explantation vorhanden. Konfokale Mikroskopie zeigt die Anwesenheit einer einzigen Schicht in der Nähe der Vorderkante, um mehr als zwei Schichten von Keratozyten nahe der Skala mit Neutrophilen sichtbar oberhalb, unterhalb und zwischen den Zellen Keratozyten Blättern.

Zu frühen Zeitpunkten, Zellen auf dem Rand des mehrschichtigen Explantat polarisieren, Initiieren kollektiven Migration Keratozyten aus dem Explantat mit anfänglichen Geschwindigkeiten von ~ 145 & mgr; m / h beträgt. Das von dem Explantat abgedeckt schnell zunimmt, was zu Zellausbreitung, Spannung in dem Blatt, und eine verringerte Vorschubgeschwindigkeit von der Vorderkante. Rapid Umwandlungen zwischen führenden und folgenden Zellen werden an der Vorderkante während der Bildung und der Schließung von spontan gebildeten Löcher in der Folie ⁷ beobachtet. Wie dieEMT-Prozess mit dem Explantat initiiert weiterhin die Blattfragmente und die Keratozyten verlieren ihre spezielle, schnelle Beweglichkeit. Genexpression und morphologischen Veränderungen, die mit EMT, Wundheilung, und Entzündungsreaktionen auftreten, innerhalb von 7 Tagen Kultur mit Explantaten erwogen fähig ca. 10 Tage ^14.