الزرد خلية قرنية إإكسبلنتس لدراسة الهجرة الجماعية خلية وعودة التظهرن في شفاء الجروح الجلدية

وقد ركزت دراسات الحركة خلية تقليديا على الخلايا المهاجرة بشكل فردي. وقد أثبتت Keratocytes مثقف من الأسماك والبرمائيات إإكسبلنتس أن يكون نظام نموذج قوي لدراسة آليات حركية الخلية باستخدام النمذجة كلا التجريبية والرياضية تقترب ^1-6. وساعد العمل التجريبي على الخلايا المهاجرة بشكل فردي عن طريق السريع، وسلاسة الحركة مزلق من الخلايا، مع الحفاظ على شكل موحد، والسرعة، والاتجاه. ومع ذلك، في الجسم الحي، والخلايا في كثير من الأحيان تتحرك بشكل جماعي مع الحفاظ على تقاطعات خلية خلية، وخاصة خلال مرحلة التطور الجنيني، التئام الجروح، والانبثاث. وهكذا، الهجرة الخلية الجماعية هي منطقة النمو وبارزة على نحو متزايد من البحوث في مجال الهجرة الخلية. وقد تم مؤخرا وصف الهجرة الجماعية من هذه الخلايا ⁷ ولها العديد من المزايا الفريدة التي تجعل من نظام قوي لدراسة الهجرة الخلية الجماعية في نموذج التئام الجروح.

ove_content "> وعندما التقطه جداول من الزرد الكبار تخدير، لا تزال بعض الأنسجة الظهارية التي تعلق على الجانب السفلي من الجدول. عند إضافة مستنبت الخلية، وهذه الخلايا الظهارية، أو keratocytes، تهاجر بسرعة كوحدة جماعية من الحجم الكبير. و يمكن الاطلاع على ثقافة يزدرع باعتبارها الظهارية الجرح نموذج الشفاء، حيث تقوم الخلايا تهاجر بعيدا عن يزدرع كما يفعلون عبر مصفوفة المؤقت جرح سرير لإعادة تأسيس ظهارة سليمة. وتشير البيانات الحديثة إلى أن هذا خارج الحي يقلد الثقافة العديد من الميزات لل في الجسم الحي التئام الجروح في الزرد الكبار. معدلات إغلاق الجرح ⁸ تترجم إلى سرعة هجرة مماثلة لتلك التي لوحظت في فيفو السابقين نظام ^7. وبالإضافة إلى ذلك، في جرح في الجسم الحي الشفاء نموذج، والمعاملة مع الوارفارين تشير إلى أن الإرقاء ليس له تأثير على معدل للشفاء، بينما العلاج مع الهيدروكورتيزون لتقليل استجابة مناعية لا يؤخر عودة التظهرن ⁸ </سوب>. كما لا تنزف الزرد عند إزالة نطاق من الحيوان، الارقاء ليست لاعبا رئيسيا. على الرغم من أننا قد وجدت خلايا المناعة في إإكسبلنتس، ونحن لم درست الآثار التي قد تترتب على الهجرة الخلية الجماعية.

يصف بروتوكول المعروضة هنا كيفية تأسيس الزرد الثقافات خلية قرنية يزدرع أن ضمان الاتساق واستنساخ للاستخدام في العديد من المقايسات البيولوجية. هذه الثقافات يزدرع هي مقنعة خاصة في نموذج المختبر للهجرة الخلايا الجماعية لعدة أسباب. أولا، keratocytes الزرد هي الخلايا الأولية المستخدمة في غضون ساعات من إقامة الثقافات يزدرع. ولذلك، فإن هذه الخلايا لا خضعت لتغيرات مورفولوجية والتعبير الجيني المرتبط مرور الخلايا الأولية ^9-13. ثانيا، هذا النظام يمثل نموذجا لدراسة عودة التظهرن ردا على إصابة ^14، وكجزء من الاستجابة للإصابة، وهو الظهارية لالوسيطة TRيبدأ ansition (EMT) عملية كما يتضح من التغيرات في التعبير الجيني وإعادة ترتيب هيكل الخلية ^14،15. وهكذا، تم التعرف على التغييرات خلفية في التعبير الجيني والحركة التي تحدث في الخلايا غير المعالجة وتوفير إطار لتفسير التغييرات مع العلاج. وعلاوة على ذلك، فإن خلية قرنية الأسماك والقرنية البشرية وتعادل وظيفيا. على حد سواء هي الخلايا الظهارية الأولية من الأنواع الخاصة بكل منها ولعب دورا رئيسيا في الظهارية التئام الجروح. الثالث، الزرد الكبار تكتسب الاعتراف كنظام نموذج لمجموعة متنوعة من الأمراض التي تصيب الإنسان ^16-18 بما في ذلك سرطان الجلد وغيرها من أنواع السرطان ^19-21، الجرح الجلدي الشفاء ^8،14 والأنسجة تجديد ^22-24.

المزايا الفنية لهذا النظام النموذجي هي مقنعة على حد سواء. وتتوفر من غير الهادفة للربح، ومرافق مركزية وهناك عدد متزايد من خطوط متحولة والمعدلة وراثيا. على وجه التحديد، ومشروع الطفرة اسماك الزرد (ZMP) في معهد ويلكوم ترست سانجر يهدف إلى إنشاء أليل خروج المغلوب في كل بروتين الترميز الجينات في الجينوم الزرد. حاليا، فقد تحور الجينات 11892، ما يقرب من 45٪ من الجينوم، مع 24088 الأليلات يتميز. وبالإضافة إلى ذلك، ZMP تقبل المقترحات وسوف تولد تدق الرافضة مجانا. الطرق الحديثة في ضربة قاضية الجينات في اليرقات والكبار الزرد ^25-28 توفر المرونة اللازمة لدراسة وظيفة الجينات الهامة تنمويا التي النهج المعدلة وراثيا هي إشكالية أو غير عملية.

بسبب بمعدلات سريعة للغاية على من الحركة من ~ 145 ميكرون / ساعة بعد وقت قصير من إنشاء الثقافات ^29، فحوصات يمكن أن تكتمل بسرعة (عادة في 24 ساعة أو أقل). كما التجارب يمكن أن تكتمل بسرعة والثقافات تنمو بشكل جيد في RT، العديد من العقبات التقنية المرتبطة يتم تجنب المقايسات الثدييات الهجرة الخلية التي تنطوي المجهري الفيديو. وبالإضافة إلى ذلك، في سن تشديد ميزانيات البحوث، zebrafوبسهولة وبتكلفة زهيدة الحفاظ على العش.

هيكل وسلوك يزدرع معقد. وبما أن الأسماك لا تنزف عند إزالة النطاق، وأنه من غير المرجح أن أكثر بكثير من طبقات البشرة السطحية وإزالتها مع الحجم. تظهر Keratocytes أن يكون نوع من الخلايا السائد في يزدرع عندما تتم إزالة المقاييس في البداية من الأسماك كما تظهر الغالبية العظمى من الخلايا لوصمة عار مع الأجسام المضادة لمكافحة E-كادهيرين ^14. وعلاوة على ذلك، ليس هناك أي دليل من الخلايا الليفية في ثقافة الأولية كما تقرره غياب فيمنتين تلطيخ المناعي ^14. ومع ذلك، مع إزالة القشور المتكررة، يبدو أن هناك العديد من العدلات في النباتى (انظر فيديو 1). لقد حددنا هذه الخلايا كما العدلات بناء على الملاحظات الشكلية من حجمها، بسرعة الحركة، وهجرتهم من ورقة خلية عندما تتعرض لLPS (لا تظهر البيانات). بالإضافة إلى ذلك، هذه الخلايا وصمة عار الطرافة الزاهيةح أجسام مضادة لعامل عصاري خلوي العدلات وكذلك مع مجموعة متنوعة من الأجسام المضادة مفتش الثانوية، مما يدل على أن لديهم FcRs وفيرة على سطحها (لا تظهر البيانات). طبقات خلايا متعددة موجودة ضمن النباتى. المجهر متحد البؤر يكشف وجود طبقة واحدة بالقرب من الحافة الأمامية لأكثر من طبقتين من keratocytes بالقرب من النطاق مع العدلات مرئية فوق، تحت، وبين الأوراق خلية قرنية الخلية.

في نقاط زمنية مبكرة، الخلايا على حافة متعدد الطبقات يزدرع استقطاب، وبدء الهجرة الجماعية للkeratocytes من يزدرع بأسعار الأولى من ~ 145 ميكرون / ساعة. المنطقة التي تغطيها يزدرع يزيد بسرعة، مما يؤدي إلى خلية نشر والتوتر داخل ورقة، وانخفاض معدل مسبقا من الحافة الأمامية. ويلاحظ interconversions السريع بين الخلايا القائد والتابعين على حافة الرائدة خلال تشكيل وإغلاق الثقوب تشكلت عفويا خلال ورقة ^7. وبما أنوتستمر عملية EMT بدأت مع يزدرع، شظايا ورقة وتفقد keratocytes المتخصصة، والقدرة على الحركة السريعة لها. التعبير الجيني والتغيرات المورفولوجية تتفق مع EMT، التئام الجروح، والاستجابات الالتهابية تحدث خلال 7 أيام من الثقافة مع إإكسبلنتس التي يجري النظر فيها قابلة للحياة لنحو 10 أيام ^14.