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Medicine

Istituzione di umano epiteliali Enteroids e Colonoids dal tessuto intero e biopsia

Published: March 06, 2015
doi:
10.3791/52483
, , , ,
1Department of Pediatric General and Thoracic Surgery,Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 2Department of Medicine, Section of Gastroenterology and Hepatology,Baylor College of Medicine

Summary

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Abstract

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed “enteroids” when derived from small intestine and “colonoids” when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Introduction

L'epitelio rivestimento del tratto gastrointestinale è in costante rinnovamento. Questo processo è innescato da proliferazione delle cellule staminali intestinali (ISC) che producono continuamente progenie di sostituire rapidamente l'epitelio intestinale come si gira. Il vano proliferativa comprendente le ISC si limita al fondo delle cripte. Le ISC danno origine a una progenie che alla fine differenziarsi in assorbimento o lignaggi secretoria. Spostamento dalla cripta e sulla villi o la superficie epitelio, cellule si differenziano progressivamente quando migrano verso l'alto prima di esfoliazione nel lume 1. ISC danno origine a tutti i tipi di cellule epiteliali intestinali tra cui enterociti, cellule, cellule microfold enteroendocrine, cellule del calice, cellule ciuffo e cellule Paneth. Il colon è caratterizzato da cripte allungati composte principalmente di colonociti e cellule calice, con enteroendocrine sparse e cellule ciuffo 2.

Ex vivo culsistemi ture costituiscono strumento promettente per lo studio ISC manutenzione e omeostasi tessuto intestinale. Tuttavia, è difficile fare affidamento su tecnologie di coltura di tessuti come condizioni fisiologiche non sono completamente riprodotti e il microambiente epiteliale spesso alterati 3,4. Un grande passo avanti nel campo ISC è stata la creazione di tecniche di coltura di tessuti per mantenere ed espandere i singoli CSI murini utilizzando fattori di crescita definiti per sostituire i normali segnali di nicchia intestinale. Condizioni di coltura a lungo termine sono stati descritti da Sato et al., In cui singoli cripte o cellule staminali isolate dalla epitelio intestinale crescono a formare strutture epiteliali 3-dimensionale compresa più domini cripta simili 5-7. Queste strutture tridimensionali subiscono eventi di fissione per espandere continuamente. È interessante notare, tutti i tipi di cellule intestinali specifici del tessuto di origine vengono prodotti e così vengono estrusi in un lume 8. Usando modifiche di questo sistema, epitelialeorganoidi possono essere generati dallo stomaco, intestino tenue e colon. Più specificamente, organoidi epiteliali dell'intestino tenue sono enteroids 9, e quelli del colon sono colonoids 9,10. Questi epiteliali sistemi di coltura organoide sono stati utilizzati per testare la capacità di isolate cellule singole a funzionare come cellule staminali in vitro, testando così la "staminalità" di cellule isolate 5,6,10-15. Altri ricercatori hanno usato sia enteroids e colonoids per studiare la funzione di singole cellule epiteliali 16-21. Così, le culture e enteroid colonoid possono essere utilizzati per valutare sia le funzioni di staminali e di cellule non-staminali e dare una nuova visione delle interazioni cellulari fondamentali all'interno dell'intestino.

Nel 2011, Sato e colleghi generato cultura a lungo termine di organoidi epiteliali derivati ​​dal piccolo intestino umano e colon 22,23. Oltre alle differenze nella composizione media, le enteroids epiteliali umanee colonoids presentano le stesse caratteristiche come la loro controparte murina. Inoltre, possono essere generati da tessuti malati come l'esofago di Barrett, adenoma o adenocarcinoma, e fibrosi cistica 22,24. Enteroids umane costituiscono un sistema prezioso per lo studio delle cellule staminali intestinali e epiteliali della mucosa biologia e servire come un sistema sperimentale romanzo studiare la fisiologia gastrointestinale sia normale e anormale 3.

Qui si descrivono i metodi per stabilire enteroids e colonoids dal piccolo intestino umano e cripte del colon (Figura 1). In questa recensione metodologica, sottolineiamo la raccolta cripta dal tessuto insieme e biopsie. Abbiamo Ricapitoliamo le modalità di coltura che sono essenziali per la crescita e il mantenimento di enteroids e colonoids umani e le possibili strategie sperimentali svolte da questo modello di successo.

Protocol

NOTA: Etica Dichiarazione: Tutti sperimentazione utilizzando tessuti umani descritti nel presente documento è stato approvato da un IRB a CCHMC (IRB # 2012-2858; # 2.014-0.427). Il consenso informato per la raccolta dei tessuti, lo stoccaggio e l'uso dei campioni è stato ottenuto da donatori a CCHMC. 1. Preparazione per la Cultura NOTA: Tutti i reagenti sono elencati nella tabella 1. Preparare soluzione stock EDTA come segue: preparare 0,5 M di acido etilendiamminotetraacetico, pH 8 (EDTA) in ultrapura H 2 O, filtro sterilizzato con 0,22 micron filtro. Facoltativamente, conservare la soluzione EDTA stock in RT a tempo indeterminato. Preparare tampone chelante come segue: mescolare 2% sorbitolo, 1% di saccarosio, 1% frazione albumina sierica bovina V (BSA) e 1x Gentamicina / soluzione amfotericina in fosfato di Dulbecco tamponata salina senza Ca 2+ e Mg 2+ (DPBS), filtro sterilizzato con 0,22 micron filtro. Preparare il buf chelantefer fresco. Preparare medio Wnt-3A condizionata come segue: media Wnt-3A-condizionata è fatta in casa utilizzando la linea cellulare L Wnt-3A secondo le istruzioni del produttore (ATCC, CRL-2647). Supplemento alla media con glutammina 2 mM, HEPES 10 mM, 100 U / ml di penicillina, 100 g / ml di streptomicina, 1 N2 supplemento, 1 B27 supplemento, 1% BSA e filtro sterilizzato con filtro 0,22 micron. NOTA: test ogni lotto per l'attività Wnt usando un test TOPflash. Utilizzare una stabile linea cellulare HEK293 TOPflash (Hans Clevers laboratorio) con un kit di test luciferasi Renilla secondo le istruzioni del produttore. Normalizzare il saggio TOPflash con 100 ng / ml ricombinante Wnt-3A umana. Conferma almeno un'attività di 10 volte cambiamento dei media condizionati rispetto al controllo. Dividere fresco medio Wnt-3A-condizionata in 10 ml aliquote in 15 ml provette coniche e congelare a -20 ° C per un massimo di 6 mesi. Conservare scongelato aliquote fino a 5 giorni a 4 ° C senza perdita di attività. Prepare medio minigut umana come segue: Supplemento avanzata DMEM / F12 con glutammina 2 mM, HEPES 10 mM, 100 U / mL di penicillina, 100 g / mL di streptomicina, 1 N2 integratore, 1 B27 supplemento, 1% BSA e filtro sterilizzato con 0,22 Filtro micron. NOTA: Dividere mezzo fresco minigut umano in 10 ml aliquote in 15 ml provette coniche e congelare a -20 ° C per un massimo di 3 mesi. Conservare scongelato aliquote fino a 5 giorni a 4 ° C senza perdita di attività. Preparare mezzo completo minigut umana come segue: Preparare fresco prima cultura cripta o medio cambiamento medio minigut umana (cfr 1,4) integrato con il 50% Wnt-3A-condizionata medie (vedi 1.3), 1 mg / ml di R-spondina 1 (1: 1.000 diluizione di 1 mg / ml di brodo), 100 ng Noggin / ml (1: 1.000 diluizione di 100 g / mL archivio), 50 ng / mL EGF (1: 10.000 diluizione di 500 mg / mL archivio), 500 nM A-83 -01 (1: 1.000 diluizione 500 m stock), 10 mM SB202190 (1: 3.000 diluizione 30 magazzino mM), 10 nM [Leu] 15-Gastrina 1 (1: 10.000 diluizione 100 micronazione), Nicotinamide 10 mm (1: 100 diluizione di 1 m stock) e 1 mm N-Acetilcisteina (1: 1.000 diluizione di 1 m stock). NOTA: Conservare i media minigut umani completi fino a 2 giorni a 4 ° C senza perdita di attività. 2. Cripta isolamento da tutto il tessuto NOTA: Dalla collezione tessuti, è essenziale mantenere il campione in soluzione salina. Si raccomanda di mantenere il tessuto in ghiaccio durante il trasporto. Preparazione del campione per l'isolamento della cripta deve essere eseguita appena possibile. NOTA: Tutti i reagenti sono elencate nella Tabella 1, strumenti, attrezzature, e materiali di consumo sono elencate nella tabella 2. Preparare tutti i reagenti prima di iniziare l'esperimento. Scongelare la matrice membrana basale su ghiaccio e pre-incubare una piastra da 24 pozzetti in un CO 2 incubatore a 37 ° C. NOTA: In alternativa fare un sottile strato di matrice membrana basale utilizzando 15 microlitri / pozzetto nel centro di un 24Piastra -well e collocarlo in un incubatore CO 2 a 37 ° C. Questo passaggio facoltativo mantiene seminterrato matrice di membrana come una goccia durante la polimerizzazione. Lavare il tessuto con ghiacciata fosfato di Dulbecco tamponata salina senza Ca 2+ e Mg 2+ (DPBS). Proseguire fino al contenuto di DPBS è chiara. Usando 0,2 millimetri di diametro minutien perni, fissare il tessuto su un vetro Petri dish siliconata riempito con DPBS gelide. Allungare e pin il tessuto piana con il lato rivolto verso l'alto della mucosa. Sotto un microscopio da dissezione, rimuovere la mucosa sovrastante dalla sottomucosa e tessuto connettivo con le forbici micro-dissezione e punta fine pinze curve (Figura 2A, B). Allungare e pin la sezionato mucosa piatta sul piatto di vetro siliconato Petri con il lato rivolto verso l'alto della mucosa. La sottomucosa rimanente e del tessuto connettivo possono essere scartati o utilizzati per ulteriori esperimenti (Figura 2C). Delicatamenteraschiare la superficie della mucosa con pinze curve. Questo passo è necessario per migliorare la qualità della preparazione. Per tenue, raschiare delicatamente la mucosa per rimuovere i villi. Per colon, raschiare delicatamente la mucosa per rimuovere muco e detriti. Lavare la mucosa 3-4 volte con tampone chelazione ghiacciato per rimuovere villi e detriti. Coprire la mucosa con appena preparato tampone chelazione 2mM EDTA (200 ml 0.5 M EDTA in 49,6 ml tampone di chelazione). Porre la capsula Petri sul ghiaccio e agitare delicatamente per 30 minuti su un agitatore orbitale orizzontale. Lavare il tessuto 3-4 volte con tampone chelazione gelida, senza EDTA. Dopo il lavaggio, lasciare la mucosa in tampone chelazione gelida. Elaborare la mucosa sotto un microscopio da dissezione con pinze curve e sottili. Raschiare delicatamente la mucosa per liberare cripte intestinali utilizzando le pinze curve. Rimuovere delicatamente la sospensione cripta dalla capsula di Petri con un piPette e le trasferisce in una provetta conica da 50 ml. NOTA: controllare il tessuto per assicurarsi che quasi tutti cripte sono stati rimossi dalla mucosa. Filtrare la sospensione cripte attraverso un 150 micron in rete 2 volte. NOTA: controllare il flusso attraverso cripta arricchimento al microscopio (Figura 2D). Centrifugare la cripta di sospensione 5 min a 50 xg, 4 ° C. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet in 5 ml di tampone chelazione ghiacciata. Contare il numero di cripte per caduta di 10 microlitri della sospensione dal punto 2.15. Trasferire il numero di cripte necessari per la placcatura a 5 ml tubo a fondo rotondo. Usa 200 a 500 cripte per pozzetto di un piatto 24 pozzetti per stabilire enteroids o colonoids. Centrifugare la frazione cripta per 10 minuti a 150 g, 4 ° C. Rimuovere il surnatante. Utilizzare cripte per la cultura successiva. 3. Cripta Isolamento da biopsia Preparare tutti i reagenti primainizio dell'esperimento. Scongelare la matrice membrana basale su ghiaccio e pre-incubare una piastra da 24 pozzetti in un CO 2 incubatore a 37 ° C. Lavare la biopsia con ghiacciata fosfato di Dulbecco tamponata salina senza Ca 2+ e Mg 2+ (DPBS). Usando 0,1 millimetri di diametro minutien perni, fissare la biopsia su un vetro Petri dish siliconata riempito con DPBS gelide. Allungare e pin mucosa piatta con il lato rivolto verso l'alto della mucosa (Figura 2E). Raschiare delicatamente la superficie della mucosa con pinze curve per rimuovere villi e detriti. Questo passo è necessario per migliorare la qualità della preparazione. Lavare la biopsia 3-4 volte con tampone chelazione ghiacciato per rimuovere villi e detriti. Coprire la biopsia con appena preparato tampone chelazione 2mM EDTA (200 ml 0.5 M EDTA in 49,8 ml tampone di chelazione). Porre la capsula Petri sul ghiaccio e agitare delicatamente per 30 minuti su un agitatore orbitale orizzontale. <li> Lavare la biopsia 3-4 volte con tampone chelazione gelida, senza EDTA. Dopo il lavaggio, lasciare la biopsia nel buffer di chelazione gelida. Elaborare la biopsia sotto un microscopio da dissezione con pinze curve e sottili. Raschiare delicatamente la mucosa per liberare le cripte intestinali con pinze curve. Rimuovere delicatamente la sospensione cripta dalla capsula di Petri con una pipetta e trasferirlo in una provetta da 50 ml. NOTA: controllare il tessuto per assicurarsi che quasi tutti cripte sono stati rimossi dalla mucosa. Filtrare la sospensione cripta attraverso un nylon 150 micron maglia 2 volte. NOTA: controllare il flusso attraverso cripta arricchimento al microscopio. Centrifugare la cripta di sospensione 5 min a 50 xg, 4 ° C. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet in 1 ml ghiacciata buffer di chelazione. Trasferire la sospensione cripta in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Centrifuga la frazione cripta per 10 minuti a 150 xg, 4 ° C. Rimuovere il surnatante. </ Li> Utilizzare cripte per la cultura successiva. 4. Cripta Cultura a matrice di membrana basale Utilizzando puntali pre-refrigerati, risospendere il pellet crypt (dal punto 2.18 o 3.15) in membrana basale matrice (200 a 500 cripte / 50 ml seminterrato matrice di membrana). Applicare 50 ml di sospensione cripta a membrana matrice seminterrato per bene sul piatto pre-riscaldato. Lentamente estrarre la matrice di membrana basale nel centro del pozzo. Posizionare la piastra a 24 pozzetti a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per 30 min per permettere una completa polimerizzazione della matrice membrana basale. Sovrapporre la matrice membrana basale con 500 ml di mezzo completo minigut umano integrato con 2,5 micron CHIR99021 (1: 4.000 diluizione 10 stock mM) e 2,5 micron Thiazovivin (1: 4.000 diluizione 10 stock mM). Incubare la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. Sostituire il mezzo con Huma fresca completan minigut media ogni 2 giorni. 5. Passaging di Colta Enteroids e Colonoids. NOTA: Passage Enteroids e Colonoids ogni 7 a 10 giorni dopo la placcatura iniziale. In generale, dividere un bene nel 3 a 4 pozzi. Preparare tutti i reagenti prima dell'inizio dell'esperimento. Scongelare la matrice membrana basale su ghiaccio e pre-incubare una piastra da 24 pozzetti in un CO 2 incubatore a 37 ° C. Rimuovere il supporto con punte sterili e overlay con 1 ml di DPBS ghiacciate. Pipetta avanti e indietro con una punta di 1.000 ml. Trasferire la soluzione in un nuovo tubo da 15 ml. Aggiungere 2 ml di terreno minigut umana integrata con 5% FBS per 1 ml di terreno. Centrifugare la soluzione per 5 min a 50 xg, a 4 ° C. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet con 2 ml di dissociazione cellulare dell'enzima supplementato con 10 mM Y-27632 (1: 1.000 diluizione 10 stock mM). Incubare per 5 min a 37 ° C in un bagno d'acqua. Dissociare il grumi di cellule utilizzando una siringa da 3 ml Luer-Lock dotato di un 18-G di riempimento / ago smussato. Pipetta delicatamente la soluzione avanti e indietro con la siringa per 10 volte. Centrifugare la sospensione per 5 minuti a 500 xg, a 4 ° C. Scartare il surnatante. Utilizzando puntali pre-refrigerati, risospendere il pellet cellulare in matrice di membrana basale. Applicare 50 ml di sospensione cripta a membrana matrice seminterrato per bene sul piatto pre-riscaldato. Lentamente estrarre la matrice di membrana basale nel centro del pozzo. Posizionare la piastra a 24 pozzetti a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per 20 min per permettere una completa polimerizzazione della matrice membrana basale. Sovrapporre la matrice membrana basale con 500 ml di mezzo completo minigut umano integrato con 10 pM Y-27632 (1: 1.000 diluizione 10 stock mM). Incubare la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. Dopo 2 giorni, Sostituire il mezzo con fresco mezzo completo minigut umano supplementato con 10 micron Y-27632 (1: 1.000 diluizione 10 stock mM). Successivamente, sostituire il mezzo fresco con mezzo completo, minigut umana ogni altro giorno. 6. Il congelamento di Colta Enteroids e Colonoids NOTA: Di solito congelare un pozzetto in 2-3 cryovials. Ripetere i punti da 5.1 a 5.8. Risospendere il pellet con il mezzo di congelamento freddo. Trasferire 1 ml di congelamento soluzione in una provetta Microbank ™ etichetta. Posizionare il esageratamente in un recipiente congelamento contenente 500 ml di alcool isopropilico. Trasferire il contenitore di congelamento di un C congelatore 80 ° per 24 ore, poi il trasferimento esageratamente allo stoccaggio di azoto liquido. NOTA: Conservare Enteroids e Colonoids fino a 1 anno.

Representative Results

La figura 2D mostra un tipico esempio di cripte appena isolate da tutto il tessuto (Figura 2D). Il numero di cripte isolate da una biopsia è inferiore nel tessuto intero. Utilizzando pinze capacità standard di biopsia con ago, di solito effettuiamo due morsi biopsia su un unico passaggio. Ogni risultati morso biopsia in una superficie 10 mm 2 con una media di 50 a 100 cripte per biopsia (Figura 2F). Dopo la cultura in matrice membrana basale, le cripte completano a formare enterospheres per tenue e colonospheres per colon. La cripta erba di solito si verifica entro 5 o 6 giorni, dopo la semina. Tuttavia non è raro vedere sia enteroids (enteroids) o colonoids (colonoids) formano sfere della matrice membrana basale (Figura 3A-C, Movie 1). Il passaging può essere effettuata dopo 7 giorni, a seconda delle dimensioni delle enteroids. Il enteroids o colonoids establmentata da biopsie subiscono lo stesso sviluppo della cultura. Tuttavia, poiché la densità cripta di semina è inferiore, il passaging viene di solito effettuata dopo 10 a 12 giorni di coltura (figura 4a, b). Enteroids e colonoids culture espandono in modo riproducibile. Entrambi enteroids e colonoids presentano un lato luminale e sono rivestiti con un epitelio (Figura 5A, B). Le cellule proliferative si possono osservare nei enteroids e si trovano all'interno delle punte del germoglio (figura 5C, D). Confocale di enteroids colorati con E-caderina (Ecad) mostra le cellule epiteliali (Figura 5E). Sia enteroids e colonoids possono essere stabiliti dal tessuto ottenuti da pazienti affetti da malattie genetiche / congenite. La figura 6 mostra enteroids rappresentativi che crescono da un paziente con fibrosi cistica (Figura 6A) e una enteropatia trapunto a causa di una mutazione congenita nell'annuncio cellule epitelialigene coesio molecola (EpCAM) (Figura 6B). Oltre al difetto genetico, i enteroids non presentano differenze di condizioni basali. Figura 1. Flusso di lavoro di cripte dissociazione e la generazione di enteroids umani e colonoids in coltura. Cripte (dal piccolo intestino o colon umano) sono isolati dal EDTA chelazione. Cripte coltivate formano enteroids per l'intestino tenue e colonoids per il colon. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 2. processo di dissezione per l'isolamento cripta. (A) L'intestino tenue specimen è allungata e appuntato piatta in una capsula di Petri siliconata. (B) La mucosa è separata dalla sottomucosa sottostante. (C) La mucosa sezionato è allungata e appuntato piatta in una capsula di Petri siliconata. (D) Dopo EDTA chelazione, cripte sono isolate dal tessuto. (E) Una biopsia è allungata e appuntato piatta in una capsula di Petri siliconata. (F) Dopo EDTA chelazione, cripte sono isolati dalla biopsia. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3. cultura Cripta e enteroid umana e la generazione colonoid dal tessuto intero. (A) cripte digiunale placcato in matrice membrana basale dopo l'isolamento. Le cripte stanno chiudendo dopo 3 a 4 ore e iniziano a palloncino fino a formare enterospheres oltre tale termine. In 7 giorni, le enteroids digiunali si formano. (B) Dopo l'isolamento e la cultura, cripte ileali si comportano come le cripte digiunali e forma enteroids ileale. (C) cripte del colon sono placcati in matrice membrana basale dopo l'isolamento. Le cripte stretti e formano colonoids dopo 7 giorni (bar Scala: 100 micron). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 4. cultura Cripta e enteroid umana e la generazione colonoid dalla biopsia. (A) cripte duodenali placcato in matrice membrana basale dopo l'isolamento. Le cripte stanno chiudendo dopo 3 a 4 ore e iniziano a palloncino fino Beyond questa volta a formare enterospheres. In 7 giorni, le enteroids si formano. (B) Dopo l'isolamento e la cultura, cripte del colon sono placcati in matrice di membrana basale. Le cripte vicino a formare colonospheres poi colonoids dopo 7 giorni (bar Scala: 100 micron). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 5. intestinali lignaggi dei enteroids umane. (A) enteroid umana dopo 6 giorni di coltura. (B) sezioni ematossilina-eosina dei enteroids in (A) dimostrare l'epiteliali che rivestono (bar Scala: 100 micron). (CD) confocale di enteroids dopo EdU colorazione (magenta) indica la presenza di cellule proliferative. (E </strong>) confocale del enteroids dimostra la presenza di: E-caderina per le cellule epiteliali (ECAD, verde) (bar Scala:. 50 micron) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 6. cultura Cripta e la generazione enteroid umana dal tessuto malato. (A) Enteroids stabilito da un campione di fibrosi cistica. (B) Enteroids stabilito da un congenito esemplare tufting enteropatia (barre di scala: 100 micron). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Movie 1. Enterosphere formando enteroid umano nella cultura. 32 hr temporali girie filmato mostra un enterosphere stabilita dal piccolo intestino umano scomparsa per formare un enteroid in cultura. Clicca qui per vedere il video. Nome del reagente Azienda Numero di catalogo Solvente Archivio Concentrazione Concentrazione finale Commento Fosfato di Dulbecco tamponata salina Ca 2+, Mg 2+ gratuito (DPBS) Life Technology; Gibco 14190-144 – – 1x Etilendiammina tetraacetico (EDTA) Sigma-Aldrich 431.788 Ultrapure dH 2 O <td> 0.5 M 2 mm Sorbitolo Fischer Scientific BP439-500 DPBS Polvere 2% Saccarosio Fischer Scientific BP220-1 DPBS Polvere 1% Albumina di siero bovino (BSA) Frazione V Fischer Scientific BP1600-100 DPBS Polvere 1% Soluzione Gzntamycin / amfotericina B Life Technology; Gibco R-015-10 – 500x 1x Wnt-3A conditionned medio in casa – – – – Avanzate DMEM / F12 Life Technology; Gibco 12634-028 – – – HEPES 1M Life Technology; Gibco 15630-080 – 1 M 10 mM Glutamax (glutamina) Life Technology; Gibco 35050-061 – 100X 1X Penicillina-streptomicina (10.000 U / mL) Life Technology; Gibco 15140-148 – 100X 1X N2 Supplemento Life Technology; Gibco 17502-048 – 100X 1X B27 Supplemento Life Technology; Gibco 17504-044 – 50X 1X N-Acetilcisteina Sigma-Aldrich A9165-5G DPBS 1 M 1 mM </ Td> Nicotidamide Sigma-Aldrich N0636 DPBS 1 M 10 mM Matrigel, GFR, fenolo (matrice membrana basale) gratis Corning 356.231 – – – RICHIESTO Noggin ricombinante umana R & S 6057-NG / CF DPBS 100 ug / ml 100 ng / ml Altri fornitori: R & S; Anaspec e Preprotech umana ricombinante R-spondina Preprotech 120-38 DPBS 1 mg / ml 1 ug / ml EGF ricombinante umana Sigma-Aldrich E9644-.2MG DBPs 500 mg / ml 50 ng / ml Y-27632 Sigma-Aldrich Y0503-1MG DPBS 10 mM 10 mM A-83-01 Tocris 2939 DMSO 500 micron 500 nM SB202190 Sigma-Aldrich S7067-5MG DMSO 30 mM 10 mM umana [Leu] 15-Gastrin 1 Sigma-Aldrich G9145-.1MG DPBS 100 pM 10 nM CHIR99021 Stemgent 04-0004 DMSO 10 mM 2,5 micron Thiazovivin Stemgent 04-0017 DMSO 10 mM 2,5 micron TrypLE espresso Enzyme (1X), rosso fenolo (cellule dissociazione enzimatica) Life Technology; Gibco 12605-010 – – – Per passaging Siero fetale bovino Life Technology; Gibco 10082-147 – – – Per passaging CTS Synth-a-Freeze (media di congelamento) Medium Life Technology; Gibco A13713-01 – – – Per il congelamento Linea cellulare L Wnt-3A ATCC CRL-2647 – – – Wnt-3A conditionned produzione di media Renilla test luciferasi Promega E2710 – – – Wnt-3A conditionned attività dei media umana ricombinante Wnt-3A R & S 5036-WN / CF DPBS 100 ug / ml 100 ng / ml <td> Wnt-3A conditionned attività dei media Linea cellulare HEK293 TOPflash – – – – – Wnt-3A conditionned attività dei media; Regalo da laboratorio di Hans Clevers Tabella 1. Elenco dei reagenti dettagliato con il produttore preferito e numero di catalogo. Attrezzatura Consumabili Strumenti Cappa a flusso laminare 15 e 50 ml provette coniche Dumont # 5 pinze normali (FST; # 11251-20) CO 2 Incubatore Tubi microcentrifuga Dumont # 7, curve pinza sottile (FST; # 11274-20) Stereomicroscopio Piastre da 24 pozzetti Forbici Belle (FST; # 14060-09) <tr> Centrifuga 0.22 micron filtri (Sartorius) Forbici primavera Vännäs (FST; # 15018-10) Shaker orbitale Pipette sierologiche 0,2 millimetri di diametro minutien perni (FST; # 26002-20) Contenitore congelamento (Nalgene) Suggerimenti micropipetta 0,1 millimetri di diametro minutien perni (FST; # 26002-10) Sylgard 184 Silicone (Dow Corning) 150 micron aperture di maglia, lo screening di nylon (Dynamic Aqua-fornitura) Piatto di vetro Petri 5 ml tubi in polipropilene a fondo tondo (Falcon) Pipetta sierologica 18G ago riempimento smussato (BD) Micropipetta 3 ml lsyringes con punte Luer-Lock (BD) Cryovials <strong> Tabella 2. dettagliata di consumo, strumenti, e le attrezzature necessarie per l'isolamento e la coltura cripta.

Discussion

Questo metodo fornisce un sistema completo riprodurre linee dell'epitelio intestinale e dinamiche epiteliali che costituiscono un utile strumento per studiare la biologia epiteliale intestinale. Il metodo presentato qui è stato adattato dallo studio murino originale di Sato e Clevers 22 che si traduce in modo efficiente in enteroids umani e colonoids. Qui, abbiamo scelto manualmente le cripte per microdissezione per evitare contaminanti cellulari. Questo metodo permette una visualizzazione diretta delle cripte e porta a consistenza straordinari rispetto alla raccolta cripta originale "agitando". Altri gruppi hanno sviluppato tecniche simili utilizzando approcci leggermente diversi soprattutto sostituiscono la chelazione da EDTA con collagenasi 25. Oltre alle differenze di raccolta cripta, tali tecniche utilizzano un supporto definito che è necessaria per far crescere i enteroids umani in coltura 22. Per aumentare l'efficienza crescita a crypt semina, aggiungiamo un inibitore GSK3 (CHIR99021)per i primi due giorni a 12.

La movimentazione del tessuto o biopsie è importante e l'isolamento cripta deve essere eseguita non appena il tessuto arriva in laboratorio. Tuttavia, ritardata isolamento e la coltura cripta potrebbero essere eseguite fino a 24 ore dopo la raccolta del tessuto (dati non mostrati) come precedentemente descritto per il tessuto murino 26. Il tessuto intestinale deve essere posto in una provetta conica completamente riempito con DPBS per evitare perturbazioni del tessuto devono essere mantenuti a 4 ° C. La preparazione ritardata permette per trasporto tessuto ma la variazione di temperatura deve essere evitato durante il trasporto. Il tempo complessivo necessario per il fasciame cripta iniziale è di circa 2 ore con 15 a 30 minuti per elaborare il tessuto e da 1 a 2 ore per isolare e piastra cripta. La microdissezione del tessuto è un fattore determinante e predicato di una preparazione crypt pulito. Tuttavia, il rilascio cripta mano tremare, come descritto in diversi protocolli è possibile 22,23.

Nonostante le analogie con il sistema enteroid murino (enteroids), le enteroids umani richiedono specifiche molecole per migliorare e sostenere la loro crescita nel tempo. I fattori di crescita, EGF, Noggin, R-spondina vengono utilizzati in modo simile ai organoidi epiteliali murine. Tuttavia, l'uso di Wnt-3A è critica. Abbiamo notato che la formazione e l'efficienza di crescita è maggiore utilizzando un mezzo condizionato Wnt-3A rispetto alla proteina umana ricombinante. Contemporaneamente, abbiamo dimostrato condizioni di coltura migliorate utilizzando un inibitore della chinasi glicogeno sintasi 3 (CHIR99021) 12. Fattori di crescita ricombinanti potrebbero essere sostituiti da Wnt-3A, R-spondina, e Noggin condizionato-media. Una linea L-cell-Wnt-3A espressione è disponibile in commercio (ATCC). Altri gruppi hanno sviluppato R-spondina 1- 23,27, Noggin- 19, e Wnt-3A / R-spondin3 / Noggin- 28 esprimere linee cellulari. Due inibitori piccole molecole vengono utilizzati nella cultura media e sono necessari per il mantenimento della cultura 29. A-83-01 è un inibitore selettivo della trasformazione β fattore di crescita e Activin / recettori nodali (activina-like chinasi 4, 5, 7) e SB202190 è un inibitore della proteina chinasi p38 mitogeno-attivata (MAPK). Entrambi gli inibitori sono stati utilizzati rispettivamente per sostenere umana indotte pluripotenti cellule staminali di auto-rinnovamento e di stabilire naïve cellule staminali pluripotenti umane 30-32. Inoltre, nicotinamide, un precursore di nicotinamide adenina dinucleotide, è necessario per mantenere enteroids ed espansione colonoids in modo lungo termine 22,29.

La chelazione EDTA è un passo importante in quanto determina il rendimento dalla preparazione cripta. Abbiamo avuto successo con 2 trattamento mM EDTA. Tuttavia, la concentrazione EDTA può essere modificato da 2 mM a 15 mM relative al tipo di tessuto. In tal caso, il tempo di incubazione deve essere determinato empiricamente. Dopo la placcatura iniziale, la cripta arrotonderà-up e alla fine formano enteroids. Tuttavia, i enteroids o colonoids spesso mostrano un fenotipo "radice" formando sfere con poco o nessun cellule differenziate. In tal caso, la differenziazione può essere avviata prelevando Wnt-3A, nicotinamide e l'inibitore p38 MAPK. L'uso di inibitori Notch come DAPT o DBZ aiuta migliorare la differenziazione all'interno dei enteroids 22.

Questo modello ricapitola la fisiologia intestinale con eventi-cripta erba continui derivanti da un compartimento di cellule staminali e domini epiteliali dei villi-like contenenti sia di assorbimento e di secrezione differenziata lignaggi. È interessante notare che questo sistema non contiene cellule mesenchimali e utilizza specifiche condizioni dei media per soddisfare i requisiti del segnale di nicchia.

Come il modello murino, enteroids umani possono essere generati da isolate cellule epiteliali intestinali per testare la capacità di queste cellule di funzionare come una cellula staminale. Sevestudi ral hanno utilizzato gruppo di marcatori di differenziazione (CD44, CD24 e CD166) e le cellule positive EphB2 per arricchire per le cellule con proprietà staminali 12,23,33. Insieme, questi studi dimostrano l'utilità di enteroids umane culture per testare la staminalità. Altri ricercatori stanno utilizzando questo modello per studiare malattie intestinali quali le malattie infettive diarroiche, la fibrosi cistica, o tumori colorettali 22,34-37. Questi studi dimostrano che enteroids umani costituiscono un modello affidabile malattia umana con la possibilità di muoversi in direzione di uno screening personalizzato. Enteroids umani possono essere geneticamente modificati utilizzando trasfezione DNA o infezione con particelle virali 38. Ciò fornisce un potente strumento per studiare le funzioni specifiche del gene nei organoidi epiteliali umane o correggere le mutazioni genetiche. Recentemente, Schwank e colleghi hanno dimostrato la possibilità di modificare il genoma con il sistema CRISPR / Cas9 e correggere la mutazione sul gene CFTR causando acfibrosi ystic 24. Enteroids umane costituiscono un sistema prezioso per lo studio delle cellule staminali intestinali e epiteliali della mucosa biologia e servire come un sistema sperimentale romanzo di studiare sia normale e anormale fisiologia gastrointestinale.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We gratefully acknowledge Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands) for the kind gift of TOPflash cells.

This project was supported in part by NIH-R01DK083325 (MAH); NIH P30 DK078392 (Digestive Health Center); NIH UL1RR026314 (CTSA).

Materials

Name of Reagent Company Catalog Number
Dulbecco’s Phosphate buffered saline Ca2+, Mg2+ free (DPBS) Life technologies; Gibco 14190-144
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich 431788
Sorbitol Fischer Scientific BP439-500
Sucrose Fischer Scientific BP220-1
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V Fischer Scientific BP1600-100
Gzntamycin/Amphotericin B solution Life technologies; Gibco R-015-10
Wnt-3A conditionned medium in house –
Advanced DMEM/F12 Life technologies; Gibco 12634-028
HEPES 1M Life technologies; Gibco 15630-080
GlutaMAX (glutamine) Life technologies; Gibco 35050-061
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Life technologies; Gibco 15140-148
N2 Supplement Life technologies; Gibco 17502-048
B27 Supplement Life technologies; Gibco 17504-044
N-Acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165-5G
Nicotidamide Sigma-Aldrich N0636
Matrigel, GFR, Phenol free (basement membrane matrix) Corning 356231
human recombinant Noggin R&D 6057-NG/CF
human recombinant R-Spondin Preprotech 120-38
human recombinant EGF Sigma-Aldrich E9644-.2MG
Y-27632 Sigma-Aldrich Y0503-1MG
A-83-01 Tocris 2939
SB202190 Sigma-Aldrich S7067-5MG
human [Leu]15-Gastrin 1 Sigma-Aldrich G9145-.1MG
CHIR99021 Stemgent 04-0004
Thiazovivin Stemgent 04-0017
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red (cell dissociation enzyme) Life technologies; Gibco 12605-010
Fetal Bovine Serum Life technologies; Gibco 10082-147
CTS Synth-a-Freeze Medium (freezing medium) Life technologies; Gibco A13713-01
L Wnt-3A cell line ATCC CRL-2647
Renilla luciferase assay Promega E2710
human recombinant Wnt-3A R&D 5036-WN/CF
HEK293 TOPflash cell line – –
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Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy. J. Vis. Exp. (97), e52483, doi:10.3791/52483 (2015).
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