Cultura y Co-cultura de ratón ovarios y los folículos ováricos

Todo el trabajo de los animales se realizó de acuerdo con las directrices institucionales bajo licencia por el Ministerio del Interior del Reino Unido (número de licencia del proyecto PPL 60/1726 y 60/4026). Nota: animales Casa de conformidad con los requisitos legales del Reino Unido en una luz 14 horas y 10 horas oscuridad fotoperíodo. Realizar experimentos en animales utilizando ratones C57BL6J tipo salvaje, ratones Tau-GFP que tienen expresión ubicua de la proteína fluorescente verde (GFP) 8, y los ratones Thy1-YFP con la expresión ocasional de la proteína fluorescente amarilla (YFP) en un subconjunto de células neuronales 9: ambas líneas transgénicas fueron criados en un fondo C57BL6J. 1. Condiciones de trabajo y elaboración de instrumentos Realizar toda la preparación de medios de comunicación, las disecciones de tejidos, y el trabajo de cultivo en una campana de flujo laminar para asegurar la esterilidad: esto evita el requisito de la adición de antibióticos a los medios de comunicación. Permita siempre que los medios de comunicación / cultura placas / platos de embriones se equilibrendurante al menos 1 hora, en un horno de 37 ° C (medio de disección / platos de embrión) o 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora (medio y placas de cultivo), antes de su uso. Remojar pipetas de vidrio en solución al 0,1% de albúmina de suero bovino (BSA) durante alrededor de una hora y, a continuación dejar secar. Tire pipetas en la llama de un mechero Bunsen, doblando el cristal mientras lo hace, para producir pipetas de vidrio curvado finamente dibujados. Después se extrae la pipeta, hacer un corte limpio con un cortador de vidrio. Esterilizar horno a 160 ° C durante alrededor de 45 minutos. NOTA: Una tienda de estas pipetas de vidrio será necesario transferir los ovarios y los folículos. 2. Preparación de la disección y Medios de Cultivo Preparar Disección Medio. Disolver 3 mg / ml de BSA en medio Leibowitz L15 y esterilizar por filtración a través de un 0,2 micras de poro, filtro de 25 mm de diámetro. Neonatal Ovario Cultura. Para preparar el medio para el cultivo de ovario neonatal, hacer 1 ml de medio para each ovario que se cultivó. Disolver 3 mg / ml de BSA en-α Medio Esencial Mínimo (aMEM) y el filtro de esterilización de 0,2 micras a través de un poro, filtro de 13 mm de diámetro en un tubo estéril. Para preparar las placas para la cultura ovario neonatal, añadir 1 ml de medio de cultivo ovario neonatal en cada pocillo (un ovario por pocillo) de una placa de 24 pocillos. Con unas pinzas estériles relojero, coloque una membrana de policarbonato en la parte superior del medio en cada superficie bien, brillante hacia arriba. UV esterilizar las membranas antes de su uso. Folículo Cultura. Para preparar medio para el cultivo del folículo, los medios de comunicación esencial suplemento de α-mínimo con 1 UI / ml de la hormona estimulante del folículo humana recombinante, ácido ascórbico 5 g / ml y 5% v / v de suero obtenidas de ratones hembra adultos. Esterilizar por filtración a través de un 0,2 micras de poro, filtro de 13 mm de diámetro en un tubo estéril. Filtrar esterilizar aceite de silicio a través de un filtro de 0,45 micras de diámetro de poro, 25 mm, en un tubo estéril. Para preparar plates, coloque 30 gotas mu l de medio de cultivo de folículos en cada pocillo de una cultura no-tejido tratado de 96 pocillos de microtitulación placa de ida y así, utilizando sólo la fila superior de cada placa (para permitir que los folículos que se trasladaron a las nuevas filas cada día más el período de cultivo). Superponer cuidadosamente medio con 70 l de aceite de silicona esterilizado, para prevenir medio de la evaporación. -Folículo ovario Co-cultura. Preparar medio para-folículo del ovario de co-cultivo como para cultivo de folículos en el paso 2.3.1 anterior, lo que representa 1 ml de medio para cada co-cultivo-folículo del ovario está estableciendo. Para preparar las placas, añadir 1 ml de medio en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Con unas pinzas estériles relojero, coloque una membrana Nucleopore en la parte superior del medio en cada superficie bien, brillante hacia arriba. UV esterilizar las membranas antes de su uso. 3. Neonatal Ovario Disección y Cultura Colocar 1 ml de medio de disección en cada placa de embriones de vidrio estéril. <li> Cull crías de ratón neonatales de edades comprendidas entre 0 y postnatal día 5, el sacrificio por decapitación de acuerdo a las regulaciones del Reino Unido Home Office. Sujete la piel que cubre la pared abdominal con un par de pinzas de disección finas y hacer una gran incisión en la pared de la piel y el cuerpo. Abra la incisión para que todo el abdomen se expone. La vejiga se llena de sangre por lo general en esta etapa y puede ser perforado para hacer más fácil la disección. Mueva las tripas fuera del camino con unas pinzas relojero. Siga los cuernos uterinos de la vejiga al riñón a cada lado. El ovario se encuentra justo debajo del riñón en la parte superior del útero y aparecerá como una estructura similar a la nube con un microscopio de disección. Sujete el ovario suavemente con fórceps relojero, y usar las tijeras para cortar su conexión con el útero. Transferir el par de ovarios en platos de embriones que contienen medio disección pre-calentado. Realizar fina disección de ovarios bajo un microscopio de disección en un sta climatizadage (37 ° C). Use agujas de insulina para recortar el saco de la bursitis y cualquier exceso de material incluyendo la trompa de Falopio, hasta que sólo el ovario permanece. Transferir cada ovario en el pocillo de una placa de cultivo preparado en la etapa 2.2.2 anterior, usando una pipeta de vidrio curvada finamente dibujado, uno de los ovarios en la parte superior de cada membrana (véase la Figura 1A). Cultura en un 37 ° C, 5% de CO2. Cambiar el medio cada segundo día. Utilizar una pipeta para intercambiar el 50% del medio de cada pocillo para la pre-cámara de gas fresco medio: colocar la punta de la pipeta en el borde del pozo de medio para evitar molestar a la membrana. Mantener culturas para hasta 6 días. Al final del cultivo, la congelación medio y fijar o congelar los ovarios después de un breve lavado en PBS, según se requiera. Fijar ovarios en fijador de Bouin durante 90 min para el análisis histológico, o en 10% de formalina tamponada neutra durante 90 min para el análisis inmunohistoquímico. Snap congelar ovarios mediante la colocación de tejido enun tubo de polipropileno, colocando el tubo en hielo seco durante 5-10 minutos antes de la congelación a -70 ° C para su posterior extracción de proteína o mRNA. 4. folículo Disección y Cultura Cull 19-23 días de edad ratones hembra y aislar los ovarios. Humedezca la piel con etanol al 70% antes de hacer ninguna incisión. Pellizcar la piel con unas pinzas sin punta y hacer una incisión grande en el abdomen con tijeras de disección, penetrando a través de la piel y la pared del cuerpo. Mueva el intestino fuera del camino utilizando un conjunto más fino de los instrumentos de disección y localizar el útero. Siga el útero hasta el ovario que se encuentra por debajo de la de riñón en cada lado. Agarrando suavemente el ovario mediante un par de pinzas relojero, cortar los ovarios conexión con el útero con tijeras de disección finas. Evitar la recogida demasiado de la almohadilla de grasa de ovario. Recoge los ovarios y transferir a un embrión platos que contenían medio disección pre-calentado. Remover la bolsa ovárica utilizando agujas de insulina para recortar el saco de la bursitis y cualquier exceso de material incluyendo la trompa de Falopio, hasta que sólo el ovario permanece. Aproximadamente reducir a la mitad cada ovario usando agujas de insulina. Transfiera cuidadosamente cada ovario-media en un vidrio de reloj individual que contiene 1 ml de medio de disección. Cubrir cada vidrio de reloj con un portaobjetos de vidrio para evitar la evaporación del medio y para asegurar la esterilidad. Vidrios de reloj tienda que contienen mitades de ovario en un horno de 37 ° C hasta que sea necesario, pero llevar a cabo el siguiente paso disección tan pronto como sea posible. Deseche tejido almacenado de esta manera por más de una hora. Vidrio de reloj de transferencia que contiene un medio de ovario a una platina de microscopio calentado 37 ° C en una campana de flujo laminar. Aproximadamente diseccionar ovario en grandes piezas con dos agujas de insulina, a fin de identificar finales de los folículos pre-antrales como sigue: éstos contendrán 2-3 capas de células de la granulosa y tienen un diámetro de alrededor de 180-200 micras. Diseccionar manualmente cualquier ifolículos dentified utilizando una aguja de insulina y una de 30 x 0,25 mm aguja de acupuntura que ha sido asegurada en un soporte de la aguja. Tenga cuidado de eliminar la mayor parte del estroma circundante, pero no dañar la lámina basal de los folículos (véase la Figura 1B). Utilice una pipeta de vidrio curvo finamente elaborado para transferir cuidadosamente folículos disecados en un vidrio de reloj que contiene medio de la recolección de la disección pre-calentado. Tenga cuidado de mantener los folículos dentro de la sección de calibre fino de pipeta para evitar la pérdida de los folículos. Folículos Medir con precisión utilizando una retícula ocular calibrado montado en un microscopio de disección. Seleccione folículos para la cultura sólo si miden 190 ± 10 m de diámetro. Además seleccionar solamente, folículos esféricos saludables para la cultura; estos serán translúcido, sin zonas oscuras atretic, y tienen una lámina basal intacta, junto con parte del tejido tecal adjunto: descartar los folículos que no encajan en esta descripción. Un rendimiento de entre 10-15 folículos por ovario es bueno. Usar una pipeta de vidrio curvada finamente dibujado para transferir un único folículo en el pocillo de una placa hecha como en el paso 2.3.3 anteriormente. Colocar con cuidado el folículo en el fondo del pozo (y no en la capa de aceite superior). Cultura en un 37 ° C, 5% de CO2. Folículos de cultivo para hasta 6 días, moviendo los folículos en un medio fresco que contiene así todos los días. Preparar la siguiente fila en la placa de 96 así como en la preparación de la placa en el paso 2.3.3. Placa de retorno a la incubadora durante al menos una hora, para permitir el equilibrio. Traslado folículos en los pozos frescas de medio, con una pipeta de vidrio finamente dibujado. Si en cualquier punto en la cultura folículos se deben dejar durante dos días antes de pasar a medio fresco, colocar cada folículo en un mínimo de 60 l (en lugar de 30 l) gotas de medio de cultivo folículo. Para recoger datos sobre el crecimiento del folículo, medir los folículos diario, utilizando un eyretícula epiece montado en un microscopio de disección. La capa de aceite distorsionará mediciones del diámetro del folículo, así calcular el coeficiente de calibración para la puesta a punto. Al final del cultivo, la congelación medio y fijar o congelar el tejido para su posterior análisis, como en el paso por encima de 3,10. Folículo folículo Co-cultura. Cultura dos folículos juntos, para investigar las interacciones entre los folículos. Cultura como anteriormente, pero el lugar dos folículos de lado a lado, en contacto, en un pozo. Coloque 100 l gotas de medio de cultivo de folículos en cada pocillo de una cultura no tejido tratado de microtitulación de 96 pocillos de placa plana así, superponiendo medio con 100 l de aceite de silicona esterilizado. No transferir los folículos en los pocillos frescos como en el paso por encima de 4,13, pero en lugar de utilizar una punta fina de gel para cambiar 50% del medio cada dos días. Con el fin de identificar los orígenes de tejido dentro de la co-cultivo, de co-cultivo folículos cada uno de una fuente genética diferente, por ejemplo one desde el ovario de un ratón de tipo salvaje, y el otro desde el ovario de un ratón con expresión ubicua de GFP. Si el uso de GFP o tejido YFP, minimizar la exposición del tejido a la luz tanto como sea posible, durante el cultivo, ya través de los pasos de fijación / procesamiento a partir de entonces. NOTA: Es normal que los dos folículos crezcan juntos en una sola unidad de dos folículo '(ver Figura 1 C). 5. Co-culturas-folículo del ovario Disecar los ovarios y los folículos fuera como en las secciones 3 y 4 anteriores. Coloque un ovario neonatal en la parte superior de una membrana, en una placa preparada como en el paso 2.4.2 anteriormente. Con cuidado, coloque un único folículo en contacto con uno de los polos del ovario neonatal, usando una pipeta de vidrio curvada finamente dibujado. Cultura en un 37 ° C, 5% de CO2 durante un máximo de 5 días. Con el fin de distinguir entre el origen del tejido dentro del co-cultivo, utilizar los ovarios y los folículos de dos diferentes asíURCES, por ejemplo, uno de un tipo de ratón salvaje, y otro de un ratón con expresión ubicua de las buenas prácticas agrarias. Reemplazar 500 l de medio diario como en el paso 3.8 anterior, pero utilizando medio de cultivo folículo. Durante la co-cultura, el folículo menudo queda encapsulado por el ovario (Figura 1D). Al final del cultivo, la congelación medio y fijar o congelar el tejido para su posterior análisis, como en el paso por encima de 3,10. 6. Fijación, inmunocitoquímica e Imagen de tejido cultivado Al final del cultivo, el lavado de tejidos en PBS y transferir a 100 l (folículo) o 1 ml (ovario) de 10% de formalina tamponada neutra, y fijar, por 1 hora en hielo. Moverse a través de 3 lavados de 1x PBS a 4 ° C. Para inmunocitoquímica sobre los folículos, la transferencia entre los pocillos de una placa de microtitulación de ida y bien 96 pocillos usando una pipeta de vidrio curvada finamente dibujado, conteniendo cada pocillo diferentes lavados o tratamientos. Por inmunocitoquímica en OvariEs (o co-cultivos-ovario folículo), incrustar en el 4% en gel de agarosa y la sección a 50 micras utilizando un vibrotomo. Secciones flotar en los pocillos de una placa de 24 pocillos para aplicar lavados o tratamientos, la eliminación con una pipeta. Para imágenes: transferir secciones de agarosa a portaobjetos de vidrio plano y montar con medio de montaje; o folículos de transferencia (o complejos folículo folículo) a portaobjetos de vidrio de la cavidad y se montan con que no se endurezca medio de montaje. Especímenes de imagen utilizando un microscopio confocal.