Культура и Co-Культура мыши яичников и фолликулов в яичниках

Все для животных работа была выполнена в соответствии с ведомственным руководящим принципам по лицензии Министерство внутренних дел Великобритании (номер лицензии проект закона о госзакупках 60/1726 и 60/4026). Внимание: дом животных в соответствии с требованиями законодательства Великобритании в 14 ч света и 10 ч темноты светового дня. Проводить эксперименты на животных с использованием C57Bl6J мышей дикого типа, Тау-GFP мышей, которые имеют повсеместное выражение зеленого флуоресцентного белка (GFP) 8, и Thy1-YFP мышей с периодическим выражения желтого флуоресцентного белка (YFP) в подгруппе нервных клеток 9: как трансгенные линии были выведены на фоне C57Bl6J. 1. Условия работы и подготовка инструменты Выполните все подготовительные СМИ, ткани вскрытия и культуры работы в ламинарном потоке для обеспечения стерильности: это позволяет избежать требования добавлением антибиотиков для средств массовой информации. Всегда разрешать СМИ / культура пластин / блюда эмбрионов, чтобы уравновеситьпо крайней мере, 1 ч, в 37 ° C духовку (рассечение среды / эмбрионов посуда) или 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе (культуральной среды и пластины), до использования. Замочите стеклянные пипетки в 0,1% -ном растворе бычьего сывороточного альбумина (БСА) в течение приблизительно часа, а затем оставить до полного высыхания. Потяните пипетки в пламени горелки Бунзена, гибка стекла, как это сделать, чтобы произвести мелко нарисованные изогнутым стеклом пипетки. После пипетки втягивается, чтобы чистый срез с резаком стекла. Печь стерилизации при 160 ° С в течение примерно 45 мин. ПРИМЕЧАНИЕ: магазин из этих стеклянных пипеток будут необходимы для передачи яичников и фолликулов. 2. Подготовка Вскрытие и медиакультуры Подготовка Dissection Medium. Растворите 3 мг / мл БСА в среде L15 Лейбович и фильтр стерилизуют через 0,2 мкм поры, 25 мм диаметром фильтра. Неонатальный яичников культуры. Чтобы подготовить среду для новорожденных яичников культуры, сделать 1 мл среды для ВАСч яичника, которые можно культивировать. Растворите 3 мг / мл БСА в α-минимальной поддерживающей медиа (αMEM) и фильтр стерилизуют через 0,2 мкм поры, 13 мм диаметром фильтра в стерильную пробирку. Чтобы подготовить листы для новорожденных яичников культуры, добавляют 1 мл новорожденных яичника культуральной среды в каждую лунку (одна яичника на лунку) в 24-луночный планшет. Использование стерильных часовщик щипцов, положите одну из поликарбоната мембраны на вершине среды в каждую лунку, блестящей поверхности вверх. УФ стерилизации мембраны перед использованием. Фолликулостимулирующий культуры. Чтобы подготовить среду для фолликула культуры, добавки α-минимальной поддерживающей среды с 1 МЕ / мл рекомбинантного человеческого фолликулостимулирующего гормона, 5 мкг / мл аскорбиновой кислоты и 5% об / об сыворотки, полученной от взрослых самок мышей. Фильтр стерилизуют через 0,2 мкм поры, 13 мм диаметром фильтра в стерильную пробирку. Фильтр стерилизуют силиконовое масло через 0,45 мкм пор, фильтр 25 мм в диаметре, в стерильную пробирку. Чтобы подготовить плаTES, разместить 30 мкл капли фолликула культуральной среды в каждую лунку в культуре ткани, не обрабатывают микротитровальных круглым-луночного планшета 96-а, с использованием только верхний ряд каждой пластины (чтобы позволить фолликулы, которые будут перемещены в новые строки каждый день в течение Период культура). Тщательно наложить среда с 70 мкл стерилизованной силиконового масла, чтобы предотвратить испарение среды. Фолликулостимулирующий яичников Co-культура. Подготовка среды для фолликулостимулирующего яичников совместного культивирования, как и для фолликула культуры в шаге 2.3.1 выше, составляя 1 мл среды для каждого фолликула-яичник совместно культуры создаются. Для приготовления пластины, добавить 1 мл среды в каждую лунку 24-луночного планшета. Использование стерильных часовщик щипцов, положите одну нуклеопорные мембрану в верхней части среды в каждую лунку, блестящей поверхности вверх. УФ стерилизации мембраны перед использованием. 3. новорожденных яичников Вскрытие и культура Поместите 1 мл рассечение среды в каждой стерильной стеклянной эмбриона блюдо. <LI> отбирать новорожденных щенков мыши в возрасте от послеродовой день 0 и 5, выбраковка путем обезглавливания в соответствии с правилами Британского МВД. Возьмитесь за оболочку, покрывающую брюшную стенку с помощью пары тонких рассечение пинцетом и сделать большой разрез в коже и стенке тела. Выдвиньте разрез так весь живот подвергается. Мочевого пузыря, как правило, наливается на данном этапе и могут быть проколоты, чтобы сделать рассечение проще. Перемещение кишки из пути, используя часовщик щипцами. Последующие рогов матки, из верхнего мочевого пузыря в почки на каждой стороне. Яичник расположен чуть ниже почки в верхней части матки и появится в виде облака, как структуры под микроскопом рассекает. Возьмитесь яичник осторожно часовщик щипцов и использовать ножницы, чтобы разорвать свою привязанность к матке. Передача пара яичников в эмбриональных блюд, содержащих подогретого рассечение среды. Выполните точную рассечение яичников под микроскопом рассечение на нагретой ГНАGE (37 ° С). Использовать инсулин иглы Отрезать бурсы мешок и излишки материала, включая маточную трубу, пока только яичник не остается. Передача каждого яичника в лунку планшета для культуры, полученного на стадии 2.2.2 выше, с использованием мелко обращается изогнутую стеклянную пипетку, один яичник на вершине каждой мембраны (см фиг.1А). Культура в 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора. Изменение среды каждый второй день. Используйте пипетку для обмена 50% от среды, в каждую лунку предварительно газом свежей средой: Место пипетки на краю колодца среде, чтобы избежать нарушения мембраны. Поддержание культуры до 6 дней. В конце культуры, заморозить среднего и исправить или заморозить яичники после краткого стирки в PBS, как это требуется. Закрепить яичников в фиксаторе Буэна в течение 90 мин для гистологического анализа, или в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 90 мин для иммуногистохимического анализа. Привязать заморозить яичники путем размещения ткани вполипропиленовую трубку, поместив трубку в сухом льду в течение 5-10 мин перед замораживанием при -70 ° С для последующего извлечения белка или мРНК. 4. Фолликулостимулирующий Вскрытие и культура Cull 19-23 день самкам мышей и изолировать яичники. Смочите шерсть с 70% этанола до внесения каких-либо разрезов. Ущипнуть кожу с помощью тупыми щипцами и сделать большой разрез в брюшной полости с рассечение ножницами, проникая через как кожи, так и стенки тела. Перемещение кишечник в сторону, используя тонкую набор рассечение инструментов и найдите матки. Последующие матку до яичника, который расположен ниже почек на каждой стороне. Осторожно держа яичник с помощью пары часовщика щипцов, разорвать привязанность яичников в матку с мелкими ножницы рассечение. Избегайте сбора слишком много яичников жировой ткани. Сбор яичники и передачи в эмбрион блюд, содержащих подогретого рассечение среды. Репереместить яичников Бурса, применяющих инсулин иглы Отрезать бурсы мешок и излишки материала, включая маточную трубу, пока только яичник не остается. Примерно вдвое каждом яичнике, применяющих инсулин иглы. Тщательно передачи каждом яичнике половину в отдельный часовым стеклом, содержащим 1 мл рассечение среды. Обложка каждого часового стекла с стекло для предотвращения испарения среды и обеспечения стерильности. Магазин часовые стекла, не содержащие яичников половинки в 37 ° C духовке до нужен, но выполнять следующий шаг рассечение как можно скорее. Отменить ткани хранится таким образом в течение более часа. Передача часы стекло, содержащее яичника половину 37 ° C этапе подогревом микроскопа в капюшоне ламинарного потока. Грубо рассекают яичника на крупные куски с помощью двух игл инсулина, с тем чтобы определить поздно предварительно антральных фолликулов в следующем: они содержат 2-3 слоев зернистых клеток и имеют диаметр около 180-200 мкм. Вручную рассекать из любого гdentified фолликулы с помощью одного инсулина иглу и один 30 х 0,25 мм акупунктуры иглы, которые были закреплены в держателе иглы. Быть осторожным, чтобы удалить большую часть окружающей стромы, но не повредить базальной пластинки фолликулов (см фиг.1В). Используйте мелко обращается изогнутые стеклянную пипетку, чтобы тщательно передачи расчлененные фолликулов в сборный часовым стеклом, содержащим подогретого рассечение среды. Будьте осторожны, чтобы сохранить фолликулы в разделе тонкой калибра пипетки, чтобы избежать потери фолликулов. Измерение фолликулов точно, используя калиброванный окуляр координатную сетку устанавливают в рассекает микроскопом. Выбор фолликулы для культуры только тогда, когда они измеряют 190 ± 10 мкм в диаметре. Далее выбираем только здоровые, сферических фолликулов в области культуры; они будут полупрозрачными, без темных атретических районах, а также иметь неповрежденную базальную пластинку, наряду с некоторыми прилагается дурального ткани: отказаться от любых фолликулы, которые не соответствуют этому описанию. Выход между 10-15 фолликулов в яичнике хорошо. Используйте мелко обращается изогнутым стеклом пипетки для передачи одного фолликула в лунку планшета составил, как и в шаге 2.3.3 выше. Осторожно поместите фолликул в нижней части скважины (не в верхнем слое масла). Культура в 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора. Культура фолликулы до 6 дней, двигаясь фолликулов в лунку, содержащую свежую среду каждый день. Подготовьте следующую строку в 96-луночного планшета и в подготовке пластины на этапе 2.3.3 выше. Вернуться пластину инкубатора, по крайней мере час, чтобы уравновешивание. Трансфер фолликулов в свежие лунки среде, используя тонко нарисованный стеклянную пипетку. Если в любой момент в культуре фолликулы, чтобы быть оставлен в течение двух дней, прежде чем перейти в свежую среду, разместить каждый фолликул в минимальном количестве 60 мкл (вместо 30 мкл) капелек фолликул культуральной среде. Для сбора данных по росту фолликулов, измерения фолликулы ежедневно, используя еуepiece сетка установлена ​​в рассекает микроскопом. Масляный слой будет искажать измерения диаметра фолликулов, так отработать калибровочный коэффициент для настройки. В конце культуры, заморозить среднего и исправить или заморозить ткани для последующего анализа, а на этапе 3,10 выше. Фолликулостимулирующий фолликул Co-культура. Культура два фолликула вместе, чтобы исследовать взаимодействие между фолликулов. Культура, как указано выше, но разместить два фолликула бок-о-бок, в контакте, в хорошо. Поместите 100 мкл капель фолликула культуральной среды в каждую лунку в культуре ткани, не обрабатывают 96-луночных микротитрационных плоский-луночного планшета, наложение среду с 100 мкл стерилизованной силиконового масла. Не передать фолликулов в свежие лунки, как в шаге 4,13 выше, но вместо этого использовать наконечник тонкой гель изменить 50% среды каждый день. Для того чтобы определить происхождение тканей в пределах совместного культивирования, совместное культивирование фолликулов друг от другого генетического источника, например, Oпе из яичника дикого типа мыши, и другой из яичника мыши с вездесущей выражения GFP. При использовании GFP или YFP ткани, свести к минимуму воздействие на ткани, чтобы зажечь как можно больше, во время культивирования, и через ряд шагов, фиксация / обработки в дальнейшем. ПРИМЕЧАНИЕ: Это нормально для двух фолликулы расти вместе в один "два фолликула" блока (рис 1в). 5. фолликул яичника сокультурах Проанализируйте яичников и фолликулов, как в разделах 3 и 4 выше. Разместите один новорожденных яичник на вершине мембраны, в тарелке, полученного, как в шаге 2.4.2 выше. Осторожно поместите один фолликул в контакте с одним полюсом новорожденных яичника, используя тонко нарисованный изогнутую стеклянную пипетку. Культура в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе в течение до 5 дней. Для того, чтобы различать ткани происхождения, в со-культуры, воспользуйтесь яичников и фолликулов из двух различных такurces, например один из мыши дикого типа, и один из мышей с повсеместной экспрессии GFP. Замените 500 мкл среды ежедневно, как в шаге 3,8 выше, но с использованием фолликул культуральной среде. В совместной культуре, фолликул часто становится инкапсулированы яичника (рис 1D). В конце культуры, заморозить среднего и исправить или заморозить ткани для последующего анализа, а на этапе 3,10 выше. 6. Фиксация, Иммуноцитохимия и изображений культивируемых тканей В конце культуры, мыть ткани в PBS и передачи 100 мкл (фолликул) или 1 мл (яичника) в 10% нейтральном формалине с буфером, и фиксации в течение 1 часа на льду. Перемещение по 3 промывками 1x PBS при 4 ° С. Для иммуногистохимии на фолликулов, переход между лунки микротитрационного круглым-луночный планшет в 96-луночный с помощью тонко обращается изогнутую стеклянную пипетку, с каждой лунке, содержащей различных промывок или лечения. Для иммуноцитохимии на OvariES (или яичника фолликул-со-культуры), вставлять в 4% -ном агарозном геле и раздел на 50 мкм с использованием vibrotome. Поплавок секции в лунки 24-луночного планшета для применения промывки или обработки, удаление с помощью пипетки. Для визуализации: передать агарозном разделы плоских стеклах и смонтировать с монтажной среды; или передачи фолликулы (или фолликул фолликула комплексы) в стеклах полости и крепление с неотвердевающей крепления среду. Образцы изображений с помощью конфокальной микроскопии.