Cultura e Co-Culture of Mouse ovários e folículos ovarianos

Todo o trabalho animal foi realizada em conformidade com as diretrizes institucionais sob licença pela UK Home Office (número de licença do projeto PPL 60/1726 e 60/4026). Nota: os animais da casa, de acordo com os requisitos legais do Reino Unido em uma luz 14 horas e 10 horas de fotoperíodo escuro. Realizam experimentos com animais utilizando ratinhos C57BL6J tipo selvagem, ratos Tau-GFP que têm expressão ubíqua da proteína fluorescente verde (GFP), 8, e ratinhos Thy1-YFP com expressão ocasional de proteína fluorescente amarela (YFP) em um subconjunto de células neuronais 9: tanto linhagens transgênicas foram criados em um fundo C57Bl6J. 1. Condições de Trabalho e Preparação de Instrumentos Realiza toda a preparação de meios, a dissecção de tecidos, e trabalho de cultura numa câmara de fluxo laminar, para assegurar esterilidade: isto evita a necessidade da adição de antibióticos para meios. Sempre permitir mídia / placas de cultura / pratos de embrião para equilibrardurante pelo menos 1 hora, num forno de 37 ° C (meio de dissecção / pratos de embriões) ou 37 ° C, 5% de CO2 (meio de cultura e as placas), antes de ser utilizado. Mergulhe pipetas de vidro em solução 0,1% de albumina de soro bovino (BSA) por cerca de uma hora, e depois deixar secar. Puxe pipetas na chama de um bico de Bunsen, dobrando o vidro como você faz isso, para produzir finamente desenhadas pipetas de vidro curvo. Após a pipeta é puxado, fazer um corte limpo com um cortador de vidro. Forno esterilizar a 160 ° C durante cerca de 45 min. NOTA: A loja destas pipetas de vidro que serão necessários para transferir ovários e folículos. 2. Preparação de Dissecção e Meios de Cultura Prepare Dissection Medium. Dissolve-se 3 mg / ml de BSA em meio de Leibowitz L15 e através de um filtro de esterilização de 0,2 mm de poro, filtro 25 mm de diâmetro. Neonatal Cultura Ovário. Para preparar o meio de cultura ovário neonatal, fazer 1 ml de meio para each ovário que serão cultivadas. Dissolve-se 3 mg / ml de BSA em Minimal Essencial-α Meios (aMEM) e através de um filtro de esterilização de 0,2 mm de poro, filtro 13 mm de diâmetro para um tubo estéril. Para preparar as placas para cultura ovário neonatal, adicionar 1 ml de meio de cultura neonatal ovário para cada poço (um ovário por poço) de uma placa de 24 poços. Utilizando uma pinça relojoeiro estéreis, coloque uma membrana de policarbonato em cima do meio em cada superfície bem, brilhante para cima. UV esterilizar membranas antes do uso. Cultura folículo. Para preparar o meio de cultura folicular, Meios suplemento α-Mínimo Essencial com 1 UI / ml de hormona folículo recombinante humano estimulador, 5 ug / ml de ácido ascórbico e 5% v / v de soro obtidas a partir de ratinhos fêmea adultos. Filtrar através de uma esterilização de poro 0,2, filtro 13 mm de diâmetro para um tubo estéril. Filtrar esterilizar o óleo de silicone através de um filtro de diâmetro de poro de 0,45 um, 25 mm, para um tubo estéril. Para preparar plates, coloque 30 gotas ul de folículo meio de cultura em cada poço de uma cultura de não-tecido tratado de 96 poços de microtitulação round-bem placa, usando apenas a linha superior de cada placa (para permitir que os folículos para ser transferidos para novas linhas a cada dia mais de o período de cultura). Cuidadosamente sobrepor médio com 70 l de óleo de silicone esterilizados, para evitar a evaporação média. Folículo-ovário Co-cultura. Prepare meio de co-cultura folículo do ovário como para a cultura do folículo na etapa 2.3.1 acima, tornando-se 1 ml de meio para cada co-cultura folículo do ovário sendo configurado. Para preparar as placas, adicionar 1 ml de meio para cada poço de uma placa de 24 poços. Utilizando fórceps de relojoeiro estéreis, colocar uma membrana Nucleopore no topo do meio em cada superfície bem, brilhante para cima. UV esterilizar membranas antes do uso. 3. Neonatal Ovário Dissecção e Cultura Coloque 1 ml de meio de dissecção em cada estéril prato embrião vidro. <li> Cull filhotes de rato recém-nascidos com idade entre 0 e pós-natal dia 5, abate por decapitação acordo com os regulamentos UK Home Office. Agarrar a pele que cobre a parede abdominal usando um par de fórceps de dissecação fina e fazer uma grande incisão na parede do corpo e pele. Abra a incisão para que todo o abdômen está exposto. A bexiga é geralmente ingurgitadas nesta fase e pode ser perfurada para tornar mais fácil a dissecção. Mova as tripas para fora do caminho usando uma pinça de relojoeiro. Seguir os cornos uterinos da bexiga até o rim de cada lado. O ovário está localizada logo abaixo do rim, na parte superior do útero e aparece como uma estrutura de nuvem sob um microscópio de dissecação. Segure o ovário delicadamente com uma pinça de relojoeiro, e usar a tesoura para cortar o seu apego ao útero. Transferir o par de ovários em placas contendo meio de dissecação de embriões pré-aquecido. Realizar dissecção multa de ovários sob um microscópio de dissecação em um sta aquecidage (37 ° C). Use agulhas de insulina para aparar o saco bursal e qualquer excesso de material, incluindo a trompa de Falópio, até que apenas o ovário permanece. Transferir cada ovário dentro do poço de uma placa de cultura preparada no passo 2.2.2, utilizando uma pipeta de vidro curvo finamente desenhadas, um ovário no topo de cada uma das membranas (ver Figura 1A). Cultura em uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2. Mudar a forma cada segundo dia. Usar uma pipeta para trocar 50% do meio em cada poço para pré-gaseados meio fresco: colocar a ponta da pipeta na borda da cavidade de forma a evitar a perturbação da membrana. Manter culturas para até 6 dias. No final da cultura, congelar médio e fixar ou congelar ovários após uma breve lavagem em PBS, como requerido. Corrigir ovários em fixador de Bouin por 90 min para análise histológica, ou em 10% de formalina tamponada neutra por 90 min para análise imuno. Encaixar congelar ovários, colocando em tecidoum tubo de polipropileno, colocando o tubo em gelo seco durante 5-10 minutos antes de congelar a -70 ° C para subsequente proteína ou extracção de ARNm. 4. Folículo Dissecção e Cultura Cull 19-23 dias de idade, os ratinhos do sexo feminino e isolar os ovários. Molhar a pele com etanol 70% antes de fazer qualquer incisões. Aperte a pele usando uma pinça terminou sem corte e fazer uma grande incisão no abdômen com tesouras de dissecação, que penetra através da pele e da parede do corpo. Mova o intestino para fora do caminho, utilizando um conjunto mais fino de instrumentos de dissecção e localize o útero. Seguir o útero até o ovário, que está localizado abaixo do rim de cada lado. Delicadamente, agarrando o ovário usando um par de fórceps relojoeiro, cortar o apego ovários para o útero com tesouras de dissecação finas. Evite coletando muito da camada de gordura de ovário. Recolha os ovários e transferir para um pratos embrião contendo meio de dissecção pré-aquecido. Remover a bolsa ovárica usando agulhas de insulina para aparar o saco bursal e qualquer excesso de material, incluindo a trompa de Falópio, até que apenas o ovário permanece. Cerca de reduzir pela metade a cada ovário usando agulhas de insulina. Transferir cuidadosamente cada ovário-metade em um vidro de relógio individual contendo 1 ml de meio de dissecção. Cobrir cada vidro de relógio com uma lâmina de vidro para evitar a evaporação do meio e para assegurar a esterilidade. Vidros de relógio da loja contêm metades de ovário num forno de 37 ° C até ser necessário, mas realizar o passo seguinte dissecção o mais rapidamente possível. Descartar tecido armazenado nesta forma durante mais de uma hora. Transferência de vidro de relógio contendo uma metade de uma fase de ovário microscópio aquecida a 37 ° C numa câmara de fluxo laminar. Aproximadamente dissecar ovário em pedaços grandes, utilizando duas agulhas de insulina, a fim de identificar folículos pré-antrais final como se segue: estes irão conter 2-3 camadas de células da granulosa e ter um diâmetro de cerca de 180-200 mm. Dissecar manualmente qualquer ifolículos dentified usando uma agulha de insulina e um 30 x 0,25 milímetros agulha de acupuntura que tem sido assegurado em um suporte de agulha. Tenha cuidado para remover a maior parte do estroma circundante, mas não danificar a lâmina basal de folículos (ver Figura 1B). Use uma pipeta de vidro curvo finamente desenhado para transferir cuidadosamente folículos dissecados em um vidro de relógio coleta contendo meio de dissecção pré-aquecido. Tenha cuidado para manter os folículos dentro da seção de calibre fino de pipeta para evitar a perda de folículos. Folículos medir com precisão usando uma retícula ocular calibrado montado em um microscópio de dissecação. Selecione os folículos para a cultura só se eles medem 190 ± 10 mm de diâmetro. Além disso, selecionar apenas folículos esféricas saudáveis ​​para a cultura; estes serão translúcido, sem áreas atréticos escuros, e ter uma lâmina basal intacta, juntamente com alguns tecidos thecal anexado: descartar qualquer folículos que não se encaixam nessa descrição. Um rendimento de entre 10-15 folículos por ovário é bom. Usar uma pipeta de vidro curvo finamente desenhadas para transferir um único folículo para dentro do poço de uma placa composta como no passo 2.3.3 supra. Cuidadosamente coloque o folículo no fundo do poço (e não na camada superior de óleo). Cultura em uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2. Folículos de cultura para até 6 dias, movendo-se folículos em um meio fresco bem contendo todos os dias. Preparar a próxima linha na placa de 96 poços como na preparação de placa no passo 2.3.3 supra. Retorno placa à incubadora durante pelo menos uma hora, para permitir o equilíbrio. Transferir folículos em poços frescas de meio, usando uma pipeta de vidro finamente desenhado. Se em qualquer ponto na cultura folículos são para ser deixado durante dois dias antes de se mudar para meio fresco, colocar cada folículo em um mínimo de 60 ul (em vez de 30 uL) de gotas de meio de cultura folículo. Para a coleta de dados sobre o crescimento do folículo, medir folículos diariamente, usando um eyepiece retícula colocada num microscópio de dissecação. A camada de óleo irá distorcer medições do diâmetro do folículo, por isso o trabalho fora do coeficiente de calibração para o set-up. No final da cultura, congelar médio e fixar ou congelar tecido para análise subsequente, tal como no passo 3.10 acima. Folículo-folículo Co-cultura. Cultura dois folículos juntos, para investigar as interações entre folículos. Cultura tal como acima, mas colocar dois folículos lado-a-lado, em contacto, em um poço. Coloque 100 ul de gotas de meio de cultura folículo em cada poço de uma cultura não-tecido tratado com 96 poços de microtitulação de placa plana poços, sobrepondo meio com 100 ul de óleo de silicone esterilizados. Não transferir folículos em poços frescos como no passo 4.13 acima, mas em vez disso utilizar uma ponta fina em gel de 50% de mudar o meio todos os outros dias. A fim de identificar origens de tecidos dentro da co-cultura, co-cultura de folículos de cada um de uma fonte diferente genético, por exemplo one do ovário de um ratinho de tipo selvagem, e o outro a partir do ovário de um rato com expressão ubíqua de GFP. Se utilizando GFP ou tecido YFP, minimizar a exposição do tecido a luz tanto quanto possível, durante a cultura, e através dos passos de fixação / processamento subsequentes. NOTA: É normal que os dois folículos a crescer juntos em uma única unidade, "duas folículo '(ver Figura 1C). 5. Folículo-Ovário co-culturas Dissecar ovários e folículos fora como nos pontos 3 e 4 acima. Coloque um ovário neonatal no topo de uma membrana, numa placa preparado como no passo 2.4.2 supra. Cuidadosamente coloque um único folículo em contacto com um pólo do ovário neonatal, utilizando uma pipeta de vidro curvo finamente desenhadas. Cultura em uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2 durante até 5 dias. A fim de distinguir entre o tecido de origem dentro da co-cultura, use ovários e folículos de dois diferentes, de modources, por exemplo, um de um rato do tipo selvagem, e um de um rato com expressão ubíqua da GFP. Substituir 500 ul de meio por dia como no passo 3.8 acima, mas utilizando um meio de cultura folículo. Durante a co-cultura, o folículo frequentemente torna-se encapsulada pelo ovário (Figura 1D). No final da cultura, congelar médio e fixar ou congelar tecido para análise subsequente, tal como no passo 3.10 acima. 6. Fixação, Immunocytochemistry e imagem de tecido cultivado No final da cultura, lavar o tecido em PBS e transferir para 100 ul (folículo) ou 1 ml (ovário) de 10% de formalina tamponada neutra, e fixar durante 1 h em gelo. Mover através de 3 lavagens de 1x PBS a 4 ° C. Para imunocitoquímica, em folículos, a transferência entre 96 cavidades de uma placa de microtitulação de poços rodada poços, utilizando uma pipeta de vidro curvo finamente desenhadas, com cada poço contendo diferentes lavagens ou tratamentos. Para immunocytochemistry em Ovaries (ou ovário folículo-co-culturas), incorporar em 4% em gel de agarose e seção em 50 mm usando um vibrotome. Secções de flutuador nos poços de uma placa de 24 poços para aplicar lavagens ou tratamentos, a remoção com uma pipeta. Para imagem: transferir seções de agarose para lâminas de vidro planas e montar com meio de montagem; ou folículos de transferência (ou complexos folículo-folículo) para lâminas de vidro da cavidade e montar com que não endureça meio de montagem. Espécimes de imagem usando um microscópio confocal.