文化と共培養マウスの卵巣と卵胞

すべての動物の作業は、英国内務省（プロジェクトライセンス番号PPL 1726分の60と4026分の60）のライセンスを受けて施設のガイドラインに従って行った。 注：ハウス動物を14時間の光の中で英国の法的要求事項及び10時間暗の光に合わせて。野生型C57BL6Jマウスに、緑色蛍光タンパク質（GFP）8、および神経細胞9のサブセット内の黄色蛍光タンパク質（YFP）の時折の発現はThy1-YFPマウスのユビキタス発現を有するタウ-GFPマウスを用いた動物行動実験。両方のトランスジェニック系統はC57BL6Jの背景に飼育した。 1.労働条件や楽器の準備無菌性を確保するために、層流フード内のすべてのメディアの準備、組織解剖、培養作業を実行します。これは、メディアへの抗生物質の添加の必要性を回避する。 常にメディア/培養プレート/胚の料理を平衡化することを可能に使用前に37℃のオーブンで少なくとも1時間、（解剖媒体/胚ディッシュ）、または37℃、5％CO 2インキュベーター（培養培地およびプレート）のために。 時間の周りのためにウシ血清アルブミン（BSA）の0.1％溶液中でガラスピペットを浸し、その後乾燥させる残す。細かく描かれた湾曲したガラスピペットを生成するために、あなたがそうするようにガラスを曲げ、ブンゼンバーナーの炎でピペットを引き出します。ピペットが引かれた後に、ガラスカッターできれいにカットをする。オーブンで約45分間160℃で滅菌する。 注：これらのガラスピペットのストアは、卵巣および卵胞を転送するために必要とされるであろう。 解剖と文化メディアの作製解剖培地を調製。 レイボビッツL15培地とフィルターで3 mg / mlのBSAを孔径0​​.2μm、直径25mmのフィルターを通して滅菌溶かす。 新生児卵巣文化。 新生児の卵巣培養用培地を準備するには、EACのために1mlの培地を作る培養される時間卵巣。 3ミリグラムを溶解/ mlのα-最小必須培地（αMEM）中のBSAとフィルターは滅菌チューブに0.2μmの孔径、直径13mmのフィルターを通して滅菌する。 新生児卵巣培養プレートを調製するために、24ウェルプレートの各ウェル（ウェル当たり1つの卵巣）に新生児卵巣培養培地1mlを加える。無菌の時計メーカーの鉗子を使用して、各ウェル中の培地の上下にポリカーボネート膜を配置し、光沢のある表面を上に。 UVは、使用する前に、膜を殺菌する。 卵胞文化。 卵胞の培養培地を調製するために、1 IU / mlの組換えヒト卵胞刺激ホルモン、5μg/ mlのアスコルビン酸および5％（v / v）の血清で補足α-最小必須培地は、成体雌性マウスから得られた。フィルタは、滅菌チューブに孔径0.2μm、直径13mmのフィルターを通して滅菌する。 フィルタは、滅菌チューブに、孔径0.45μm、直径25mmのフィルターを通してシリコンオイルを滅菌する。 ナンプラーを準備するにはTES、非組織培養の各ウェルに卵胞培養培地の30μlの液滴を配置する（卵胞毎日以上の新しい行に移動することができるように、各プレートの上部のみの行を使用して、96ウェルマイクロタイターラウンドウェルプレートを処理した培養期間）。慎重に培地の蒸発を防ぐために、滅菌したシリコンオイルの70μlの培地を重ねる。 卵胞卵巣共培養。 各卵胞卵巣共培養セットアップされるための培地1mlを構成する、上記のステップ2.3.1で卵胞培養用として卵胞卵巣共培養のための培地を準備します。 プレートを調製するために、24ウェルプレートの各ウェルに1mlの培地を加える。無菌の時計メーカーの鉗子を使用して、各ウェル中の培地の上に光沢のある表面を上にして1のNucleopore膜を配置。 UVは、使用する前に、膜を殺菌する。 3.新生児卵巣解剖と文化各滅菌ガラス胚皿に解剖培地の1ミリリットルを置きます。 <LI>カル新生仔マウスは、英国内務省の規制に従って断頭によりカリング、生後0日と5歳。 細かい解剖鉗子のペアを使用して腹壁をカバーする皮膚をつかみ、皮膚や体壁に大きな切開する。腹部全体が露出しているので、切開を開き引き出します。膀胱は、通常、この段階では充血し、切開を容易にするために穿刺することができる。 時計メーカーの鉗子を使用して邪魔になら根性を移動します。各側の腎臓に膀胱までの子宮角に従ってください。卵巣は子宮の上部にあるだけで腎臓の下に配置され、解剖顕微鏡下での雲のような構造として表示されます。 時計メーカーの鉗子で軽く卵巣をつかみ、子宮への取り付けを切断するはさみを使用しています。予め温め解剖培地を含む胚皿に卵巣のペアを転送します。 加熱されたSTA上解剖顕微鏡下で卵巣の細かい解剖を実施葛（37℃）。唯一の卵巣が残るまで、ファブリキウス嚢と卵管を含む任意の余分な材料を離れてトリミングするインスリンの針を使用してください。 細かく描か湾曲したガラスピペットを用いて、上記ステップ2.2.2で調製した培養プレートのウェルに各卵巣を転送各膜の上部に1つの卵巣（ 図1A参照 ）。 37℃、5％CO 2インキュベーター内で培養。 一日おきに培地を変更します。膜を乱すことを避けるために培地のウェルの縁で起こるピペットチップ：予備脱気新鮮培地を各ウェルに培地の50％を交換するためにピペットを使用する。 最大6日間の文化を維持します。 文化の最後に、メディアを凍結し、必要に応じて、PBS中で短時間の洗浄後に卵巣を修正または凍結。 組織学的分析のために90分間ブアン固定液に卵巣を修正し、または免疫組織学的分析のために90分間、10％中性緩衝ホルマリンで。スナップは、組織を配置することによって卵巣凍結その後のタンパク質またはmRNA抽出のために-70℃で凍結する前に5〜10分間ドライアイス中でチューブを配置するポリプロピレンチューブ。 4.卵胞解剖と文化 19-23日齢の雌マウスを淘汰し、卵巣を分離する。すべての切開を行う前に、70％エタノールで毛皮を湿ら。平滑末端の鉗子を用いて皮膚をつまみ、皮膚や体壁の両方を貫通し、解剖ハサミを腹部に大きな切開を作る。 解剖楽器の細かいセットを使用して邪魔に腸を移動し、子宮を探します。各側の腎臓の下に配置され、卵巣に子宮をフォローアップ。 静かに時計職人鉗子のペアを使用して卵巣を把握し、細かい解剖ハサミで子宮に卵巣の添付ファイルを断つ。卵巣の脂肪パッドのあまりを集めないようにしてください。卵巣を収集し、予め温め解剖培地を含む胚皿に移す。 リ唯一の卵巣が残るまで、ファブリキウス嚢と卵管を含む任意の余分な材料を離れてトリミングするインスリンの針を使用して、卵巣嚢を移動します。おおよそインスリン針を使用して、各卵巣を半減。 慎重に1ミリリットル解剖培地を含む個々の時計皿に各卵巣の半分を転送する。培地の蒸発を防止し、無菌性を確保するためにガラススライドを各時計皿を覆う。 ストアの時計、必要になるまで37℃のオーブンで卵巣半分を含むガラスが、できるだけ早く次の解剖工程を実施する。時間以上、このように保存された組織を捨てる。 層流フード内で37℃で加熱した顕微鏡ステージに卵巣半分を含むトランスファー時計皿。おおよそ次のように遅くプレ胞状卵胞を識別するために、二つのインスリン針を用いて大片に卵巣を分析：これらは、顆粒膜細胞の2〜3層を含む周り180~200ミクロンの直径を有する。 手動で私を解剖する1インスリン針と針ホルダに固定されているもの30×0.25ミリメートルの鍼治療の針を用いてdentified卵胞。周囲の間質の大部分を除去するが、卵胞の基底膜を損傷しないように注意してください（ 図1Bを参照）。 慎重に予め温め解剖培地を含む収集時計皿に解剖包を転送するために細かく描かれた湾曲したガラスピペットを使用してください。卵胞が失われないように、ピペットの薄い口径セクション内包を保つように注意してください。 解剖顕微鏡に嵌較正済み接眼目盛りを使用して正確に卵胞を測定します。 彼らは、直径が190±10ミクロンを測定する場合にのみ、培養のために卵胞を選択します。さらに文化のための唯一の健全な、球状の卵胞を選択します。これらは、暗い閉鎖のエリアせずに、半透明で、そしていくつかの添付包膜組織と一緒に、完全な基底膜を持ちます。この説明に適合しないすべての卵胞を破棄。 1の間の収量卵巣あたり0-15卵胞が良いです。 上記のステップ2.3.3のように作らプレートのウェルに、単一の卵胞を転送するために細かく描かれた湾曲したガラスピペットを使用してください。慎重に井戸の底（としない​​上部の油層内）で卵胞を置く。 37℃、5％CO 2インキュベーター内で培養。 最大6日間培養包は、毎日よく含む新鮮な培地に卵胞を移動する。 上記のステップ2.3.3におけるプレート調製と、96ウェルプレート内の次の行を準備します。平衡を可能にするために、少なくとも1時間インキュベーターにプレートを返します。転送微延伸ガラスピペットを用いて、培地の新鮮なウェルに包。 培養毛包の任意の時点で、新鮮な培地に移動する前に2日間放置する場合、60μlの卵胞培養培地（よりむしろ30μl）を液滴の最小の各卵胞を置く。 、卵胞の成長に関するデータを収集するのeyを使用して、毎日の卵胞を測定する解剖顕微鏡に嵌epiece目盛り。油層は、卵胞の直径の測定値を歪めるので、セットアップにキャリブレーション係数をうまくいく。 文化の終わりに、培地を凍結し、修正または上記のステップ3.10のように、その後の分析のための組織を凍結する。 卵胞卵胞共培養。 培養2卵胞は一緒に、卵胞の間の相互作用を調査する。培養物は、上記のように、しかし、ウェル中、接触は、2つの毛包を横並びに配置します。 滅菌したシリコンオイルの100μlの培地をオーバーレイ、96ウェルマイクロタイター平板ウェルプレートを処理した非組織培養の各ウェルに卵胞培養培地100μl液滴を置く。上記のステップ4.13のように新鮮なウェルに卵胞を転送するのではなく、一日おきに培地の50％を変更するには細かいゲルチップを使用しないでください。 共培養中の組織起源を同定するために、共培養は、例えば、oについて、異なる遺伝子源からのそれぞれを包GFPの遍在的な発現を有するマウスの卵巣からの野生型マウスの卵巣およびその他からね。 GFPまたはYFP組織を使用した場合、培養中、及びその後の固定化/処理工程を経て、できるだけ光に組織の曝露を最小限にする。 注：2包がシングル、「2-卵胞」ユニット（ 図1Cを参照）に一緒に成長するのは正常です。 5.卵胞卵巣共培養上記のセクション3と4のように卵巣と卵胞外を解剖。 上記のステップ2.4​​.2のように調製プレートに、膜の上に1新生児の卵巣を置きます。慎重に細かく描かれた湾曲したガラスピペットを用いて、新生児の卵巣の一方の極に接触して、単一の卵胞を置く。最大5日間37℃、5％CO 2インキュベーター内で培養。 共培養内の組織起源とを区別するために、そのように異なる2から卵巣の卵胞を使用urces、たとえば野生型マウスからの1、およびGFPの遍在的な発現を有するマウスからの1のために。 上記のステップ3.8のように毎日の培地500μlを交換したが、卵胞培養培地を使用した。共培養中に、卵胞は、多くの場合、卵巣（ 図1D）によってカプセル化されてしまう。 文化の終わりに、培地を凍結し、修正または上記のステップ3.10のように、その後の分析のための組織を凍結する。 6.固定、免疫細胞と培養組織のイメージング培養の最後に、PBSで組織を洗浄し、100μl（卵胞）または10％中性緩衝ホルマリン液1ml（卵巣）に移し、そして氷上で1時間固定する。 4℃で1×PBSの3回の洗浄を介して移動。 卵胞に免疫細胞化学のために、各ウェルを含む異なる洗浄または治療と、細かく描かれた湾曲したガラスピペットを用いて、96ウェルマイクロタイターラウンドウェルプレートのウェル間の転送。 ovari上の免疫細胞化学のためにES（または卵巣卵胞共培養）は、vibrotomeを使用して50ミクロンで4％アガロースゲル及びセクションに埋め込む。 24ウェルプレートのウェル中にフロート部分をピペットで除去し、洗浄または処置を適用する。 イメージングのために：平らなガラススライドにアガロースのセクションを転送し、マウンティング培地でマウント。または転送包（または卵胞卵胞複合体）空洞ガラススライドへと非硬化マウンティング培地でマウントします。共焦点顕微鏡を用いた画像の標本。