תרבות ושיתוף התרבות של עכבר שחלות וזקיקים בשחלות

כל העבודה בבעלי החיים בוצעה בהתאם להנחיות מוסדיות ברישיון על ידי משרד הפנים בבריטניה (מספר רישיון פרויקט PPL 60/1726 ו60 / 4026). הערה: בעלי חיים בית בהתאם לדרישות משפטיות בבריטניה באור 14 שעות וphotoperiod כהה 10 שעות. ניסויים בבעלי חיים התנהגות באמצעות עכברי C57Bl6J סוג בר, טאו-GFP עכברים שיש לי ביטוי בכל מקום של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) 8, ועכברים Thy1-YFP עם ביטוי מזדמן של חלבון פלואורסצנטי הצהוב (YFP) בתת-קבוצה של תאים עצביים 9: שני קווים מהונדסים גדלו על רקע C57Bl6J. 1. תנאי עבודה והכנה של מכשירים לבצע את כל הכנות התקשורת, והניתוחים רקמה, ועבודת התרבות בזרימה למינרית כדי להבטיח סטריליות: זה ימנע את הדרישה של התוספת של אנטיביוטיקה לתקשורת. אפשר תמיד תקשורת / צלחות תרבות / מנות עובר לאזןבמשך שעה לפחות 1, בתנור 37 ° C (מדיום לנתיחה / מנות עובר) או 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור (מדיום תרבות וצלחות), לפני השימוש. משרים טפטפות זכוכית בפתרון 0.1% אלבומין בסרום השור (BSA) כלשעה, ולאחר מכן להשאיר לייבוש. משוך טפטפות בלהבה של מבער בונזן, כיפוף הזכוכית כפי שאתה עושה כל כך, כדי לייצר pipettes זכוכית המעוגל נמשך דק. לאחר פיפטה נמשכת, לעשות חתך נקי עם חותך זכוכית. תנור לעקר 160 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות סביב. הערה: חנות של טפטפות הזכוכית אלה תהיה צורך להעביר השחלות וזקיקים. 2. הכנת מדיה Dissection והתרבות הכן Dissection בינוני. לפזר 3 מ"ג / מיליליטר BSA במדיום ליבוביץ L15 ומסנן לעקר באמצעות 0.2 מיקרומטר נקבובית, מסנן קוטר 25 מ"מ. יילודים שחלו תרבות. להכין מדיום לתרבות השחלה בילוד, לעשות 1 מיליליטר של מדיום לEACהשחלה h שיהיה בתרבית. לפזר 3 מ"ג / מיליליטר BSA במדיה Essential α-מינימאלי (αMEM) ומסנן לעקר באמצעות 0.2 מיקרומטר נקבובית, מסנן קוטר 13 מ"מ לתוך צינור סטרילי. כדי להכין צלחות לתרבות השחלה בילוד, להוסיף 1 מיליליטר של מדיום תרבות השחלה יילודים לכל אחד (שחלה אחת לכל טוב) גם צלחת 24 גם. בעזרת מלקחיים שען סטרילי, מקום קרום פוליקרבונט אחת על גבי המדיום בכל פני השטח היטב, מבריק. UV לעקר קרומים לפני השימוש. זקיק תרבות. להכין מדיום לתרבות זקיק, מדיה Essential תוספת α-מינימאלית עם 1 IU / ml הורמון רקומביננטי זקיק אדם גירוי, 5 מיקרוגרם / מיליליטר חומצה אסקורבית ו -5% בסרום v / v שהתקבלה בעכברים נקבה בוגרים. סנן לעקר דרך 0.2 מיקרומטר נקבובית, מסנן קוטר 13 מ"מ לתוך צינור סטרילי. סנן לעקר שמן סיליקון דרך פילטר בקוטר 0.45 מיקרומטר נקבוביות, מ"מ 25, לתוך צינור סטרילי. כדי להכין PLATES, מקום 30 טיפות μl של מדיום תרבות זקיק לבאר כל תרבות שאינה רקמה שטופל צלחת עגולה היטב microtiter 96-היטב, תוך שימוש בשורה העליונה בלבד של כל צלחת (כדי לאפשר זקיקים שעברו לשורות חדשות בכל יום על פני תקופת התרבות). כיסוי בזהירות בינוני עם 70 μl של שמן סיליקון מעוקר, על מנת למנוע אידוי בינוני. זקיק בשחלה Co-תרבות. להכין מדיום לתרבות משותפת זקיק-השחלה כלתרבות זקיק בשלב 2.3.1 לעיל, מה שהופך את 1 מיליליטר של מדיום לכל שיתוף תרבות זקיק-השחלה בשלבי קמה. כדי להכין צלחות, להוסיף 1 מיליליטר של מדיום לבאר כל צלחת 24 גם. בעזרת מלקחיים שען סטרילי, מקום אחד קרום Nucleopore על גבי המדיום בכל פני השטח היטב, מבריק. UV לעקר קרומים לפני השימוש. 3. ילודים שחלו Dissection ותרבות מקום 1 מיליליטר של מדיום לנתיחה לכל מנה עובר זכוכית סטרילית. <li> גורי עכבר יילודים ללקט בגילים שבין יום הלידה 0 ו -5, לקטו על ידי עריפת ראש בהתאם לתקנות משרד פנים בבריטניה. לתפוס את העור המכסה את דופן הבטן בעזרת זוג מלקחיים לנתיחה קנס ולעשות חתך גדול בדופן העור וגוף. משוך לפתוח את החתך כך כל הבטן חשופה. שלפוחית ​​השתן הוא בדרך כלל צבה בשלב זה ויכול להיות ניקב לעשות נתיחה קלה יותר. הזז את אומץ מהדרך באמצעות מלקחיים שען. בצע את קרן הרחם משלפוחית ​​השתן עד הכליות בכל צד. השחלה ממוקמת ממש מתחת לכליה בחלק העליון של הרחם והוא יופיע כמבנה דמוי ענן-תחת מיקרוסקופ לנתח. לתפוס את השחלה בעדינות עם מלקחיים שען, ולהשתמש במספריים לנתק זיקתו לרחם. העבר את זוג השחלות למאכלי עובר המכילים בינוני לנתיחה מחוממת מראש. לבצע נתיחת קנס של השחלות תחת מיקרוסקופ לנתיחה על sta מחומםge (37 מעלות צלזיוס). משתמש במחטי אינסולין כדי לחתוך את שק bursal וכל חומר עודף כוללים החצוצרה, עד שרק את השחלה נשארה. העבר את כל השחלה לתוך הבאר של צלחת תרבות מוכנה בשלב 2.2.2 לעיל, באמצעות פיפטה נמשכת דק מעוקלת זכוכית, שחלה אחת על גבי זה קרום (ראה איור 1 א). תרבות ב37 ° C, חממה 5% CO 2. לשנות את המדיום בכל יום שני. השתמש פיפטה להחליף 50% של המדיום בכל טוב לבינוני-גז מראש טרי: מקום קצה פיפטה בקצה של הבאר של מדיום, כדי למנוע הפרעה לממברנה. לשמור על תרבויות של עד 6 ימים. בסופו של התרבות, להקפיא בינוני ולתקן או להקפיא את השחלות אחרי שטיפה קצרה בPBS, כנדרש. תקן את השחלות במקבע של Bouin למשך 90 דקות לניתוח היסטולוגית, או ב 10% ניטראליים שנאגרו פורמלין למשך 90 דקות לניתוח immunohistological. Snap להקפיא את השחלות על ידי הצבת רקמה בצינור פוליפרופילן, הצבת הצינור בקרח יבש למשך 5-10 דקות לפני ההקפאה בC ° -70 לחלבון הבא או מיצוי mRNA. 4. זקיק Dissection ותרבות לברור נקבות עכברים ישנים 19-23 יום ולבודד את השחלות. להרטיב את הפרווה עם 70% אתנול לפני ביצוע חתכים. לצבוט את העור באמצעות מלקחיים הסתיימו בוטים ולעשות חתך גדול בבטן עם מספריים לנתיחה, חודר דרך שני העור וקיר הגוף. הזז את בטן מהדרך באמצעות סדרה של מכשירי נתיחה עדינה ולאתר את הרחם. בצע את הרחם עד שחלה בו ממוקם מתחת לכליה בכל צד. בעדינות לתפוס את השחלה בעזרת זוג המלקחיים שען, לנתק את הקובץ המצורף השחלות אל הרחם עם מספריים לנתיחה קנס. הימנע איסוף יותר מדי כרית שומן השחלות. לאסוף את השחלות ולהעביר לתוך מנות עובר המכילות בינוני לנתיחה מחוממת מראש. Reלהזיז את הבורסה השחלות באמצעות מחטי אינסולין כדי לחתוך את שק bursal וכל חומר עודף כוללים החצוצרה, עד שרק את השחלה נשארה. בערך לחצות כל השחלה באמצעות מחטי אינסולין. להעביר בזהירות כל השחלה חצי לתוך זכוכית שעון בודדת המכילה 1 מיליליטר מדיום לנתיחה. כיסוי כל זכוכית שעון עם שקופיות זכוכית כדי למנוע אידוי של מדיום וכדי להבטיח סטריליות. משקפיים שעון חנות המכילים חצאים השחלה בתנור 37 ° C עד צורך, אבל לבצע את הצעד הבא לנתיחה בהקדם האפשרי. בטל רקמה מאוחסנת בדרך זו ליותר משעה. זכוכית שעון העברה המכילה מחצית השחלה לבמת מיקרוסקופ המחומם 37 מעלות צלזיוס בזרימה למינרית. בערך לנתח השחלה לחתיכות גדולות באמצעות שתי מחטי אינסולין, על מנת לזהות זקיקים מראש Antral מאוחר כדלקמן: אלה יכילו 2-3 שכבות של תאי granulosa ויש לי קוטר של כ 180-200 מיקרומטר. באופן ידני לנתח את כל iזקיקי dentified באמצעות מחט אינסולין אחת ומחט דיקור 30 x 0.25 מ"מ אחד שכבר השיגה בבעל מחט. להיות זהיר כדי להסיר את רוב stroma מסביב, אבל לא לגרום נזק לlamina הבסיס של זקיקים (ראה איור 1). השתמש פיפטה זכוכית מעוגלת נמשכת דק להעביר בזהירות זקיקים גזורים לתוך כוס שעון איסוף המכילה בינוני לנתיחה מחוממת מראש. הקפד לשמור זקיקים בתוך קטע הקליבר הדק של פיפטה כדי למנוע אובדן של זקיקים. זקיקים למדוד במדויק באמצעות מצויד לתוך מיקרוסקופ לנתח graticule עינית מכוילת. זקיקים בחרו לתרבות רק אם הם מודדים 190 ± 10 מיקרומטר בקוטר. יתר על כן בחר זקיקים רק בריאים, כדוריים לתרבות; אלה יהיו שקופים, ללא אזורי atretic כהים, ויש לי lamina בסיס שלם, יחד עם כמה רקמות thecal מצורפים: לבטל את כל זקיקים שאינם מתאימים לתיאור זה. תשואה של בין 10-15 זקיקים לשחלה הוא טובים. השתמש פיפטה זכוכית מעוגלת נמשכת דק להעביר זקיק בודד לתוך הבאר של צלחת המורכבת כמו בשלב 2.3.3 לעיל. זהירות במקום הזקיק בתחתית הבאר (ולא בשכבת השמן העליונה). תרבות ב37 ° C, חממה 5% CO 2. זקיקי תרבות לתקופה של עד 6 ימים, נעו זקיקים למדיום חדש המכיל גם כל יום. הכן את השורה הבאה בצלחת 96-גם בהכנת צלחת בשלב 2.3.3 לעיל. חזור צלחת בחממה במשך שעה לפחות, כדי לאפשר איזון. העבר את הזקיקים לתוך בארות טריות של מדיום, בעזרת פיפטה זכוכית נמשכת דק. אם בכל נקודה בתרבות זקיקים יש להשאיר ליומיים לפני שעברנו למדיום חדש, למקם את כל זקיק במינימום של 60 μl (ולא 30 μl) טיפות של מדיום תרבות זקיק. כדי לאסוף נתונים על צמיחת זקיק, למדוד זקיקים יומיים, באמצעות EYgraticule epiece מצויד לתוך מיקרוסקופ לנתח. שכבת השמן תעוות מדידות של קוטר זקיק, כך תסתדר מקדם כיול להגדרה. בסופו של התרבות, להקפיא בינוני ולתקן או להקפיא רקמה לניתוח שלאחר מכן, כמו בשלב 3.10 לעיל. זקיק זקיק Co-תרבות. שני זקיקי תרבות יחד, לחקור אינטראקציות בין זקיקים. תרבות כאמור לעיל, אך להציב שני זקיקים צד-לצד, במגע, וב. הנח 100 טיפות μl של מדיום תרבות זקיק לבאר כל תרבות שאינה רקמה שטופל צלחת שטוחה היטב microtiter 96-היטב, שכיסה בינוני עם שמן סיליקון מעוקר 100 μl. אל תעביר את הזקיקים לתוך בארות טריות כמו בשלב 4.13 לעיל, אך במקום להשתמש בטיפ ג'ל עדין לשינוי של 50% של המדיום בכל יום אחר. על מנת לזהות את מקורות רקמות בתוך התרבות המשותפת, התרבות משותפת זקיקים כל ממקור גנטי שונה, למשל one מהשחלה של עכבר סוג בר, ואחרים מהשחלה של עכבר עם ביטוי בכל מקום של GFP. אם אתה משתמש GFP או רקמת YFP, לצמצם את החשיפה של רקמה להדליק ככל האפשר, בתרבות, ודרך שלבי קיבעון / עיבוד לאחר מכן. הערה: זה נורמלי לשני הזקיקים לגדול יחד ליחידה אחת, 'שני-זקיק' (ראה איור 1 ג). 5. שיתוף תרבויות זקיק שחלה לנתח השחלות וזקיקים החוצה כמו בסעיפים 3 ו -4 לעיל. הנח השחלה ילוד אחד על גבי קרום, בצלחת מוכנה כמו בשלב 2.4.2 לעיל. זהירות במקום זקיק בודד במגע עם מוט אחד בשחלה בילוד, בעזרת פיפטה זכוכית מעוגלת נמשכת דק. תרבות ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור עד 5 ימים. כדי להבחין בין מקור הרקמה בתוך התרבות המשותפת, להשתמש השחלות וזקיקים משני שונים כל כךurces, למשל אחד מעכבר סוג בר, ואחד מעכבר עם ביטוי בכל מקום של GFP. החלף 500 μl של מדיום יומי כמו בשלב 3.8 לעיל, אך שימוש במדיום תרבות זקיק. במהלך שיתוף התרבות, הזקיק הופך לעתים קרובות במארז ידי השחלה (1D איור). בסופו של התרבות, להקפיא בינוני ולתקן או להקפיא רקמה לניתוח שלאחר מכן, כמו בשלב 3.10 לעיל. 6. קיבוע, Immunocytochemistry והדמיה של רקמות בתרבית בסופו של תרבות, לשטוף רקמות בPBS ולהעביר 100 μl (זקיק) או 1 מיליליטר (השחלה) של 10% ניטראלי שנאגרו פורמלין, ולתקן עבור שעה 1 על קרח. לעבור 3 שוטף של 1x PBS על 4 מעלות צלזיוס. לimmunocytochemistry על זקיקים, העברה בין הבארות של צלחת microtiter 96-היטב עגולה היטב בעזרת פיפטה זכוכית מעוגלת נמשכת דק, עם כל שטיפות שונות המכילות גם או טיפולים. לimmunocytochemistry על ovaries (או השחלה זקיק שיתוף תרבויות), להטביע ב 4% agarose ג'ל וסעיף 50 מיקרומטר באמצעות vibrotome. חלקים לצוף בבארות של צלחת 24 גם ליישם שטיפות או טיפולים, הסרת עם טפטפת. הדמיה: להעביר סעיפי agarose שקופיות זכוכית שטוחות והר עם ההרכבה בינונית; או זקיקי העברה (או מערכות זקיק זקיק) לשקופיות זכוכית חלל והר עם לא-התקשות הרכבה בינונית. דגימות תמונה באמצעות מיקרוסקופ confocal.