Cultuur en co-cultuur van de Muis eierstokken en ovariële follikels

Alle dierlijke werk werd uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen onder licentie door het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken (project licentienummer PPL 60/1726 en 60/4026). Opmerking: Huis dieren in overeenstemming met de Britse wettelijke eisen in een 14 uur licht en 10 uur donker fotoperiode. Gedrag dierproeven met wildtype muizen C57Bl6J, Tau-GFP muizen die alomtegenwoordige expressie van groen fluorescent eiwit (GFP) 8 en Thy1-YFP muizen met af expressie van geel fluorescerend eiwit (YFP) in een subset van neuronale cellen 9 hebben: beide transgene lijnen werden gekweekt op een C57Bl6J achtergrond. 1. arbeidsomstandigheden en voorbereiding van instrumenten Voer alle media bereiding, weefsel dissecties en cultuur werken in een laminaire stroming kap steriliteit: vermijdt de eis van de toevoeging van antibiotica media. Altijd toestaan ​​media / cultuur platen / embryo gerechten in evenwichtten minste 1 uur in een 37 ° C oven (dissectie medium / embryo schotels) of 37 ° C, 5% CO2 incubator (cultuurmedium en platen), voorafgaand aan gebruik. Soak glazen pipetten in 0,1% oplossing van bovine serum albumine (BSA) voor ongeveer een uur, en dan laten drogen. Trek pipetten in de vlam van een bunsenbrander, buigen het glas als je dat doet, om fijn getekende gebogen glazen pipetten te produceren. Na de pipet wordt getrokken, is een schone snede met een glassnijder. Oven steriliseren bij 160 ° C gedurende ongeveer 45 min. OPMERKING: Een opslag van deze glazen pipetten nodig om eierstokken en follikels dragen. 2. Voorbereiding van Dissection en Cultuur Media Bereid Dissection Medium. Los 3 mg / ml BSA in Leibowitz L15 medium en filter gesteriliseerd door een 0,2 um porie, 25 mm filter. Neonatale Ovarium Cultuur. Tot medium te bereiden op neonatale ovariumcultuur, maak 1 ml medium voor each eierstok die worden gekweekt. Los 3 mg / ml BSA in α-Minimal Essential Media (aMEM) en filter gesteriliseerd door een 0,2 um porie, 13 mm diameter filter in een steriele buis. Om platen te bereiden op neonatale ovariumcultuur, voeg 1 ml van neonatale eierstok kweekmedium in elk putje (één eierstok per putje) van een 24-well plaat. Met steriele horlogemaker tang, plaats een polycarbonaat membraan bovenop het medium in elk putje, glanzend oppervlak tot. UV steriliseren membranen voor gebruik. Follikel cultuur. Om medium voorbereiding follikel cultuur supplement α-Minimal Essential Media met 1 IU / ml recombinant humaan follikel stimulerend hormoon, 5 ug / ml ascorbinezuur en 5% v / v serum verkregen van volwassen vrouwelijke muizen. Filter steriliseer door een 0,2 um porie, 13 mm diameter filter in een steriele buis. Filter steriliseer siliconenolie met een diameter 0,45 pm porie, 25 mm, in een steriele buis. Om pla bereidentes, Breng 30 pl druppels follikel kweekmedium in elk putje van een niet-weefselkweek behandelde 96-well microtiterplaten met ronde putjes met alleen de bovenste rij van elke plaat (zodat follikels in nieuwe rijen worden bewogen elke dag over de kweekperiode). Overlay zorgvuldig medium met 70 pi gesteriliseerd siliconenolie, tot medium verdamping te voorkomen. Follikel-eierstok Co-cultuur. Bereid medium voor follikel-eierstok co-cultuur als voor follikel cultuur in stap 2.3.1 hierboven, die samen 1 ml medium voor elke follikel-eierstok co-cultuur opgezet. Om petrischaal, voeg 1 ml medium in elk putje van een 24-wells plaat. Met steriele horlogemaker tang, plaats een Nucleopore membraan bovenop het medium in elk putje, glanzend oppervlak tot. UV steriliseren membranen voor gebruik. 3. Neonatale Ovarium Dissection en Cultuur Plaats 1 ml dissectie medium in elke steriele glazen embryo schotel. <li> Cull neonatale muis pups in de leeftijd tussen postnatale dag 0 en 5, ruimen door onthoofding volgens Britse ministerie van Binnenlandse Zaken regelgeving. Pak de huid die de buikwand met behulp van een paar fijne dissectie pincet en maak een grote snede in de huid en het lichaam muur. Trek opent de incisie, zodat de hele buik wordt blootgesteld. De blaas wordt gewoonlijk gezwollen in dit stadium kan worden doorboord om ontleding te vergemakkelijken. Verplaats het lef uit de weg met behulp van horlogemaker tang. Volg de baarmoederhoorns van de blaas naar de nieren aan elke kant. De eierstok ligt net onder de nieren bovenaan de baarmoeder en zal verschijnen als een wolk structuur onder een stereomicroscoop. Pak de eierstok voorzichtig met horlogemaker tang, en gebruik een schaar om zijn gehechtheid aan de baarmoeder te verbreken. Breng de paar eierstokken in embryo vaat met voorverwarmde dissectie medium. Het uitvoeren van fijne dissectie van eierstokken onder een dissectie microscoop op een verwarmde stage (37 ° C). Gebruik van insuline naalden weg te trimmen de bursitis sac en het overtollige materiaal met inbegrip van de eileider, totdat alleen de eierstok blijft. Breng elke eierstok in het putje van een kweekplaat bereid in stap 2.2.2, gebruikmakend van een fijn getekende gebogen glazen pipet, een eierstok bovenop elk membraan (zie figuur 1A). Cultuur in een 37 ° C, 5% CO2 incubator. Veranderen om de dag het medium. Gebruik een pipet 50% van het medium wisselen elk putje voor pre ontgast vers medium: plaats de pipetpunt aan de rand van de put drager niet te verstoren het membraan. Handhaaf kweken tot 6 dagen. Aan het einde van de kweek, bevriezen medium repareren of eierstokken bevriezen na een korte wassen in PBS, zoals vereist. Fix eierstokken in Bouin's fixatief 90 min voor histologische analyse, of in 10% neutraal gebufferde formaline gedurende 90 min voor immunohistologische analyse. Snap bevriezen eierstokken door het plaatsen van weefsel ineen polypropyleen buis, het plaatsen van de buis in droogijs gedurende 5-10 minuten voor bevriezen bij -70 ° C voor daaropvolgende eiwit of mRNA-extractie. 4. Follikel Dissection en Cultuur Ruimen 19-23 dagen oude vrouwelijke muizen en isoleren van de eierstokken. Maak de vacht met 70% ethanol alvorens een incisies. Huidplooi met stompe uiteinden pincet en een grote incisie in de buik met dissectie scharen, doordringen tot zowel de huid als de lichaamswand. Beweeg de darm uit de weg met behulp van een fijnere set van dissectie instrumenten en zoek de baarmoeder. Volg de baarmoeder naar de eierstok die zich onder de nier aan elke kant. Voorzichtig grijpen de eierstok behulp van een paar pincetten horlogemaker, scheiden de eierstokken bevestiging aan de baarmoeder met fijne dissectie schaar. Vermijd het verzamelen van te veel van de ovariële vet pad. Het verzamelen van de eierstokken en de overdracht tot een embryo gerechten met voorverwarmde dissectie medium. Reverplaats de ovariële bursa met behulp van insuline naalden weg te trimmen de bursitis sac en het overtollige materiaal met inbegrip van de eileider, totdat alleen de eierstok blijft. Ruwweg halveren elke eierstok met behulp van insuline naalden. Breng elke eierstok-half voorzichtig in een individuele horlogeglas met 1 ml dissectie medium. Bedek elk horlogeglas met een glasplaatje om verdamping van medium te voorkomen en om de steriliteit te waarborgen. WINKEL horlogeglazen bevattende eierstok helften in een 37 ° C oven totdat het nodig zijn maar zich de volgende dissectie stap zo snel mogelijk. Gooi weefsel opgeslagen op deze manier voor meer dan een uur. Transfer horlogeglas met een eierstok halve tot 37 ° C verwarmd microscooptafel in een laminaire stroming kap. Ongeveer ontleden eierstok in grote stukken met twee insuline naalden, teneinde late pre-antrale follikels identificeren als volgt: deze zullen 2-3 lagen granulosacellen bevatten en hebben een diameter van ongeveer 180-200 urn. Handmatig ontleden elke identified follikels met behulp van een insuline naald en een 30 x 0,25 mm acupunctuur naald die is verzekerd in een naaldhouder. Wees voorzichtig om het grootste deel van de omliggende stroma te verwijderen, maar voorkomen dat schade aan de basale lamina van follikels (zie figuur 1B). Gebruik een fijn getekende gebogen glazen pipet om ontleed follikels zorgvuldig over te dragen in een verzamelen horlogeglas met voorverwarmde dissectie medium. Wees voorzichtig om follikels te houden binnen de dunne kaliber gedeelte van de pipet om te voorkomen dat follikels. Maatregel follikels nauwkeurig met behulp van een geijkte oculairgraticule gemonteerd in een dissectie microscoop. Selecteer follikels voor cultuur alleen als ze meten 190 ± 10 micrometer in doorsnede. Selecteer verder alleen gezond, sferische follikels voor cultuur; deze zullen doorzichtig zijn, zonder donkere atretische gebieden, en hebben een intacte basale lamina, samen met enkele bijgevoegde thecal weefsel: gooi geen follikels die niet passen in deze beschrijving. Een opbrengst van tussen 10-15 follikels per ovarium is goed. Gebruik een fijn getekende gebogen glazen pipet om een ​​enkele follikel te zetten in het putje van een plaat gemaakt als in stap 2.3.3. Plaats de follikel voorzichtig in de bodem van de put (en niet in de bovenste olielaag). Cultuur in een 37 ° C, 5% CO2 incubator. Culture follikels tot 6 dagen, bewegen follikels in een putje met vers medium elke dag. Bereid de volgende rij in de 96-well plaat zoals in plaat bereiding in stap 2.3.3. Terug plaat incubator voor minstens een uur equilibratie mogelijk. Transfer follikels in de frisse putten van medium, met behulp van een fijn getekende glazen pipet. Als op enig moment in de cultuur follikels worden gelaten gedurende twee dagen alvorens naar vers medium, plaatst elke follikel in een minimum van 60 pl (in plaats van 30 ui) druppels follikel kweekmedium. Om gegevens op de follikelgroei te verzamelen, meten follikels dagelijks, met behulp van een eyepiece raster gemonteerd in een dissectie microscoop. De olielaag zullen metingen van de follikel diameter vervormen, dus werken de kalibratiecoëfficiënt voor de set-up. Aan het einde van de kweek, bevriezen medium repareren of te bevriezen weefsel voor latere analyse, zoals in stap 3.10 hierboven. Follikel-follikel Co-cultuur. Cultuur twee follikels bij elkaar, om de interacties tussen de follikels te onderzoeken. Cultuur als hierboven, maar plaatst u twee follikels side-by-side, in contact, in een put. Plaats 100 pl druppels follikel kweekmedium in elk putje van een niet-weefselkweek behandelde 96-well microtiterplaat vlakke-well plaat bedekken medium met 100 ui gesteriliseerd siliconenolie. Niet follikels in de frisse putten overdragen zoals in stap 4.13 hierboven, maar in plaats daarvan gebruik maken van een fijne gel tip om 50% te veranderen van het medium om de andere dag. Om weefsel oorsprong in de co-cultuur identificeren co-cultuur follikels elk uit een andere genetische bron, bijvoorbeeld one van de eierstok van een wildtype muis, en de andere uit de eierstok van een muis met alomtegenwoordige expressie van GFP. Bij gebruik van GFP of YFP weefsel minimaliseren blootstelling van weefsel zo veel mogelijk licht tijdens cultuur, en door de fixatie / verwerkingsstappen daarna. OPMERKING: Het is normaal dat de twee follikels om samen te groeien in een enkele, 'twee-follikel' eenheid (zie figuur 1C). 5. Follikel-Ovarium Co-culturen Ontleden eierstokken en follikels uitgevoerd als in de afdelingen 3 en 4 hierboven. Plaats een neonatale eierstok op een membraan, in een plaat bereid als in stap 2.4.2 hierboven. Plaats voorzichtig één follikel in contact met één pool van de neonatale eierstok, met een fijn getekende gebogen glazen pipet. Cultuur in een 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende maximaal 5 dagen. Om onderscheid te maken tussen het weefsel oorsprong binnen de co-cultuur, gebruiken en eierstokken follikels uit twee verschillende dusurces, bijvoorbeeld een van een wild-type muis, en één van een muis met alomtegenwoordige uitdrukking van GFP. Breng 500 pi medium dagelijks zoals in stap 3.8 hierboven, maar met follikel kweekmedium. Tijdens de co-cultuur, de follikel vaak ingekapseld wordt door de eierstok (figuur 1D). Aan het einde van de kweek, bevriezen medium repareren of te bevriezen weefsel voor latere analyse, zoals in stap 3.10 hierboven. 6. Fixatie, Immunocytochemie en beeldvorming van Gekweekte Tissue Eind cultuur, wassen weefsel in PBS en overdragen aan 100 pl (follikel) of 1 ml (eierstok) 10% neutraal gebufferde formaline en vast gedurende 1 uur op ijs. Bewegen door 3 wasbeurten van 1x PBS bij 4 ° C. Voor immunocytochemie van follikels, transfer van putjes van een 96-well microtiterplaat round-well plaat met een fijn getekende gebogen glazen pipet, waarbij elk putje met verschillende wasbeurten behandelingen. Voor immuuncytochemie op Ovaries (of eierstok-follikel co-culturen), insluiten in 4% agarosegel en rubriek 50 micrometer met een vibrotome. Float secties in de putjes van een 24-putjesplaat wasbeurten behandeling toepassen, verwijderen met een pipet. Voor de beeldvorming: overdragen agarose secties om vlak glas dia's en monteren met montage medium; of overdracht follikels (of follikel-follikel complexen) om holte glas dia's en monteer met niet-verharding montage medium. Afbeelding monsters met een confocale microscoop.